同位素稀释-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱定量分析复杂样品中恩诺沙星研究

杨梦瑞 李 鹏，2 王 敏 周 剑 王彤彤 张丽媛 刘 芳

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081； 2.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037）

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOF－MS） 是一种软电离质谱分析技术，其主要通过待测样品与具有紫外吸光特性的基质形成共结晶，在激光辐照下解吸附并离子化，进而实现对目标物的质谱检测。 由于其具有保证分子结构完整性的软电离特点，因此广泛应用于蛋白质、 聚合物、多肽等大分子化合物相对分子质量的准确测定[1]。由于MALDI－TOF－MS 具有高通量、 灵敏、 快速等优点，近年来，在小分子化合物分析、 质谱成像、 微生物鉴定等重要领域也得到广泛应用[2～5]。但是，传统有机MALDI 基质在激光的辐照下容易在小分子质量范围内形成碎片干扰，因此，通过采用无机纳米颗粒作基质[6～7]、 介孔材料修饰[8～10]、 新型有机基质替代[11～12]等手段，可以消除干扰，实现MALDI－TOF－MS分析检测有机小分子化合物的目标。 此外，由于基质与样品结晶的不均匀性以及激光辐照的随机性，导致MALDI－TOF－MS的测量重复性较差，极大制约了MALDI－TOF－MS的定量分析能力。

为实现MALDI－TOF－MS定量分析的目的，目前学者们主要开展两个方面研究，一是提高待测样品在MALDI 基质中的均匀分布，提高测量的重现性与重复性[13]。 研究表明，纳米颗粒负载沸石后能够有效提高MALDI－TOF－MS测量的重复性，例如碲化镉纳米颗粒负载于介孔沸石表面，能够显著降低纳米颗粒的团聚效应，达到均匀分散，显著改善了MALDI－TOF－MS测量硬脂酸的重复性[14]。二是选择合适的内标物。 目前，内标物的选择主要集中在稳定同位素标记内标物，由于其与目标小分子具有相同的物理化学性质，在MALDI 源的离子化效率相同； 同时，一些与目标小分子结构相似的化合物，由于其离子化效率与被测物离子化效率具有一定的相似性，也可以用作内标物来定量分析。

恩诺沙星（ENR） 属于氟喹诺酮类广谱抗菌药物，由于在动物养殖过程中的不规范使用，导致残留问题突出，对动物源食品安全与公共卫生造成很大的威胁与影响。 因此，为加强监管，国家标准GB 31650－2019 《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》 规定，恩诺沙星与其残留标志物环丙沙星之和在牛奶、 羊奶中最大残留限量（MRL）为100 μg/kg，家禽产蛋期为禁用。 高效液相色谱法 （HPLC）、 液相色谱串联质谱法 （LC－MS/MS）等广泛应用于复杂样品中恩诺沙星的测定。 由于动物源基质较为复杂，样品前处理步骤较为繁琐与费时，而MALDI－TOF－MS具有样品前处理简单、高通量、 快速、 灵敏的技术优势，是一种具有潜力的分析方法。

本研究采用前期研究的MALDI 复合基质[15]，重点探讨了同位素稀释质谱法结合MALDI－TOFMS定量分析复杂阳性样品中药物小分子的可行性，考察了方法的线性、 重复性以及准确性，并针对MALDI－TOF－MS定量分析小分子化合物提出了思考与展望。

一、 材料与方法

（一） 实验仪器与材料MALDI－TOF－MS 质谱仪配置波长337 nm 的高频固态激光器（Autoflex Speed，布鲁克公司，美国）； Beta 沸石（先丰纳米材料科技有限公司，中国） 负载的α－氰基－4－羟基肉桂酸（CHCA，Sigma 公司，美国）； 恩诺沙星纯品（TCI 公司，日本）； 恩诺沙星－D5纯品（LGC公司，英国）； 甲醇、 乙腈等其他常用有机试剂（Merck 公司，德国）； 鸡蛋、 牛奶为市售商品。

（二） 实验方法

1.阳性样品制备。 准确称取牛奶、 鸡蛋液空白样品200 g，分别添加一定量的恩诺沙星固体粉末，并充分混匀后制备含有恩诺沙星药物的阳性样品，待平衡后分装至样品瓶中，于4℃条件冷藏。

2.样品前处理。 分别准确称量1.0 g 阳性样品于15 mL 离心管中，加入一定量恩诺沙星－D5溶液，并准确记录质量，涡旋5 min 后室温下平衡1 h。待充分平衡后，加入1% 甲酸乙腈提取液8 mL，涡旋混匀2 min，以10000 r/min 低温 （4℃） 离心10 min，取上清液过0.22 μm 尼龙滤膜，室温下使用氮气吹扫至体积约1 mL。 牛奶样品直接上机分析； 蛋液需进一步加入水饱和的正己烷4 mL 除脂，以10000 r/min 低温（4℃） 离心5 min 后取下层清液上机。

3.点板与质谱分析。 点板时，分别移取0.5 μL 经过前处理的待测样品与复合基质于样品板上混合，重复上述步骤，待溶剂挥发完全形成结晶后上机分析。 MALDI－TOF－MS采用正离子方式，连续采集500 张质谱图累加后作为最终质谱图，采用Igor Pro 软件对原始数据分析并作图。

4.校准曲线与结果计算。 配制0.5、 1.0、 2.0、4.0、 8.0 mg/kg 一系列恩诺沙星标准溶液，分别添加4.0 mg/kg 的同位素内标 （恩诺沙星－D5），以标准溶液中恩诺沙星与恩诺沙星－D5的质量比与对应的质谱峰面积比拟合校准曲线。 在待测样品中添加一定量的恩诺沙星－D5，质谱分析后采用校准曲线计算。 计算方式见公式（1）。

公式（1）中，X1为被测物的质量浓度（mg/kg）；A1为仪器测得的样品溶液中被测物的峰面积；A2为仪器测得的样品溶液中同位素标记物的峰面积；M1为加入样品中的同位素标记物的质量 （mg）；MS为样品的质量（kg）；f为待测物与同位素内标物的校正因子。

二、 结果与讨论

（一） 定量可行性分析由于MALDI－TOFMS 不具有LC－MS 等串联质谱的在线分离功能，具有相同质量数的干扰物成为影响MALDI－TOFMS 定性定量分析复杂样品中目标化合物的关键因素。 为了排除内源性物质的干扰，首先采用MALDI－TOF－MS 分析了经过前处理的空白蛋液、 牛奶样品，得到的质谱图见图1。 如图1 所示，虽然在低质量数范围内质谱峰较为复杂，但是在质荷比m/z360、m/z365 均未见明显的质谱峰，认为经过上述前处理后，没有来自具有相同质荷比的内源性化合物的干扰。 同样，采用上述方法，上机分析添加了恩诺沙星－D5同位素内标的阳性样品，获得的质谱图见图2。 从图2 中可以发现，目标质谱峰[ENR+H]+和[ENR－D5+H]+在m/z360 和m/z365 成功被检出。 因此，认为可以采用恩诺沙星－D5作为同位素稀释剂，对阳性蛋液、 牛奶中的恩诺沙星开展MALDI－TOF－MS 定量分析研究。

图1 空白牛奶样品 （A） 和空白蛋液样品 （B） 的MALDI-TOF-MS 质谱图

图2 添加同位素内标后的阳性牛奶样品 （A） 和蛋液样品 （B） 的MALDI-TOF-MS 质谱图

（二） 方法学考察由于基于与样品共结晶均匀性差以及激光辐照的随机性，造成MALDITOF－MS 测量重复性差，因此MALDI－TOF－MS定量分析存在一定的局限性。 一方面是通过不断改进基质材料来提高测量重复性达到定量的目的，另一方面是选择合适的内标物来定量，而同位素标记物则被认为是最理想的内标。 本研究选择恩诺沙星－D5为同位素内标，配制0.5、 1.0、 2.0、 4.0、8.0 mg/kg 一系列恩诺沙星标准溶液，分别添加4.0 mg/kg 的同位素内标，旋混均匀后分别与基质混合共结晶于样品板上，上机分析。 以标准溶液中恩诺沙星与恩诺沙星－D5的质量比与对应的峰面积比拟合直线（见图3）。 如图3 所示，恩诺沙星在0.5～8.0 mg/kg 范围内线性关系良好，相关系数为0.998。由此可见，通过使用同位素内标，可以有效减少MALDI－TOF－MS 测量随机性带来的定量偏差。

图3 校准曲线

阳性样品测定时，按照目标物与同位素内标1∶1 的原则，添加一定量的恩诺沙星－D5，待充分平衡并前处理后上机分析，并采用校准曲线校准计算。 本研究考察了MALDI－TOF－MS定量测定蛋液、 牛奶中恩诺沙星的测量重复性，结果见表1。如表1 所示，蛋液测定结果组间组内的相对标准偏差 （RSD） 均＜1%，牛奶测定结果组间组内RSD均＜5%，表明方法的精密度良好，满足定量要求。同时，采用添加回收考察了方法的准确性，按照测定结果的25%、 50%和100%加标后采用同样的方法测定，结果见表2。 如表2 所示，蛋液样品3 个不同浓度水平的回收率在96.7%～100.0%之间，牛奶样品3 个浓度水平的回收率在97.4%～99.2%之间，由此说明方法的准确性较高，符合定量要求。 综上所述，结合同位素内标，实现了MALDITOF－MS 定量分析蛋液、 牛奶阳性样品中恩诺沙星药物的含量。

表1 阳性蛋液、 牛奶样品中恩诺沙星测定结果

表2 阳性蛋液、 牛奶样品中恩诺沙星加标回收率实验结果 （n＝3）

（三） 局限性分析与展望本研究中，通过质谱数据处理软件Flex Analysis 以3 倍信噪比和10倍信噪比确定该方法的检出限与定量限，分别对应浓度为0.5 mg/kg 和2.0 mg/kg，高于动物源产品中恩诺沙星残留检测限量，因此在实际检测应用时具有一定的局限性。 这主要受限于MALDI－TOFMS仪器自身进样方式。 当激光辐照样品板上的样品结晶时，只有激光光斑激发部位的极少量样品离子化后进入TOF 飞行管到达检测器产生信号，由此说明仪器自身的检出限远远低于方法的检出限。针对上述局限性，一方面通过对前处理后的样品浓缩后上样，提高上机浓度，达到残留检测要求； 另一方面，未来可以通过研究具有特异性吸附作用的新型MALDI 基质来富集目标化合物，提高靶板样品中待测物的绝对含量，进而达到满足MALDITOF－MS残留检测的要求。

三、 结论

本研究通过采用同位素稀释质谱法，克服了MALDI－TOF－MS定量重复性、 准确性差的问题，实现了MALDI－TOF－MS定量分析蛋液、 牛奶等复杂阳性样品中恩诺沙星药物含量。 研究结果表明，方法的线性良好，测量重复性与准确性满足定量要求。 该方法的建立为MALDI－TOF－MS定量分析小分子化合物提供了一种借鉴与参考。