基于16S rDNA高通量测序研究针灸对克罗恩病大鼠肠道菌群的调节作用

钟蕊 林亚莹 朱毅 吴焕淦 孙可鑫 黄艳 祁琴 吴璐一

摘要 目的：采用16S rDNA高通量測序技术分析针灸对克罗恩病（CD）大鼠肠道菌群物种相对丰度和多样性的影响，探讨针灸对克罗恩病的作用机制。方法：将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、隔药饼灸组、电针组和西药组，每组8只。采用2，4，6-三硝基苯磺酸溶液灌肠4周构建CD大鼠模型，隔药饼灸组和电针组选取天枢（双侧）、气海穴进行干预，西药组采用柳氮磺吡啶溶液灌胃干预。干预结束后取结肠组织进行HE染色，收取大鼠粪便进行16S rDNA高通量测序并对进行物种相对丰度、alpha多样性和基因功能代谢预测分析等。结果：隔药饼灸组和电针组大鼠结肠组织病理学评分显著低于模型组（P<0.01）。与正常组比较，模型组拟杆菌门、放线菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目、紫单胞菌科、普雷沃菌科、拟杆菌科、普雷沃菌属等的相对丰度升高，厚壁菌门、变形菌门、梭菌纲、梭菌目、毛螺菌科、瘤胃菌科、乳酸杆菌属等的相对丰度降低;在经过隔药饼灸和电针治疗后，上述大多数微生物相对丰度均有不同程度改善。与正常组比较，模型组肠道菌群的Chao1、Observed species、Shannon、Simpson等alpha多样性指数均显著下降（P<0.05）;与模型组比较，隔药饼灸组和电针组上述指数均显著升高（P<0.05）。功能预测分析发现隔药饼灸和电针均能调节参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢等的功能基因。结论：CD与肠道菌群结构变化有关，针灸能够调节CD大鼠肠道菌群物种相对丰度和菌群多样性。

关键词 克罗恩病;针灸;肠道菌群;高通量测序;功能预测

Regulatory Effect of Acupuncture and Moxibustion on Gut Microbiota of Rats with Crohn′s Disease Based on 16S rDNA High-throughput Sequencing

ZHONG Rui1，LIN Yaying2，ZHU Yi2，WU Huangan2，3，SUN Kexin3，HUANG Yan2，QI Qin2，WU Luyi2，3

（1 Shanghai Qigong Research Institute，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200030，China; 2 Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai 200030，China; 3 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China）

Abstract Objective：To analyze the effects of acupuncture and moxibustion on the relative abundance and diversity of gut microbiota in rats with Crohn′s disease （CD） by 16S rDNA high-throughput sequencing and explore the mechanism of acupuncture and moxibustion on CD.Methods：Forty SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，an indirect moxibustion group，an electroacupuncture （EA） group，and a western medicine group，with eight rats in each group.The CD model was induced in rats by enema with 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid for four weeks.The bilateral “Tianshu” （ST 25） and “Qihai” （CV 6） were selected for intervention in the indirect moxibustion group and the EA group，and the rats in the western medicine group received sulfasalazine solution by gavage.After the intervention，the colon tissues and rat feces were collected for HE staining and 16S rDNA high-throughput sequencing，respectively.The sequencing results were analyzed for species relative abundance，alpha diversity，and functional gene prediction.Results：The histopathological scores of colon tissues of rats in the indirect moxibustion group and the EA group were significantly lower than those in the model group （P<0.01）.Compared with the normal group，the model group showed the increased relative abundance of Bacteroidetes，Actinobacteria，Bacteroidia，Bacteroidales，Porphyromonadaceae，Prevotellaceae，Bacteroidaceae，and Prevotella，and the decreased relative abundance of Firmicutes，Proteobacteria，Clostrida，Clostridiales，Lachnospiraceae，Ruminococcaceae，and Lactobacillus.After indirect moxibustion and EA treatment，the relative abundance of the majority of the above-mentioned microorganisms improved to varying degrees.Compared with the normal group，the model group displayed decreased alpha diversity indexes of the gut microbiota，such as Chao1，Observed species，Shannon，and Simpson （P<0.05）.Those indexes were elevated in the indirect moxibustion group and the EA group（P<0.05）as compared with those in the model group.As revealed by functional prediction analysis，both indirect moxibustion and EA could regulate functional genes involved in carbohydrate metabolism and amino acid metabolism.Conclusion：CD is related to changes in the structure of gut microbiota，and acupuncture and moxibustion can regulate the relative abundance and diversity of gut microbiota in CD rats.

Keywords Crohn′s disease; Acupuncture and moxibustion; Gut microbiota; High-throughput sequencing; Functional prediction

中图分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.004

克罗恩病（Crohn′s Disease，CD）是一种反复发作的慢性肠道炎症疾病，可累及胃肠道的各个部位。本病在临床上常表现为腹痛、腹泻，病程多迁延，不易根治。其发病机制尚未明确，目前多认为与遗传、感染、肠道微生态失衡以及免疫紊乱等相关[1]。近年来大量研究指出，肠道菌群失调与CD发生发展关系密切。CD患者肠道菌群与正常人存在明显差异，常表现为CD患者体内有益菌数量减少，病原菌和致病菌数量增加以及肠道菌群多样性显著降低等[2]。本病常规治疗药物主要包括氨基水杨酸类、糖皮质激素和免疫抑制剂等，但疗效并不理想，且存在一定的不良反应。因此，寻找一种安全有效的治疗手段至关重要。

针灸具有安全、复发率低以及远期疗效好等特点，作为一种补充替代疗法广泛地被临床所应用[3-5]。现代许多临床研究表明针灸在改善CD患者临床症状、控制病情活动、维持缓解方面具有较好的疗效[6-8]。课题组前期研究表明针灸对CD患者具有良好的治疗效果，能够缓解CD患者的临床症状和体征，有效减轻CD患者结肠炎症反应，并能影响CD结肠黏膜组织异常的基因表达谱[9]。然而针灸对CD大鼠肠道菌群的调节作用尚不清楚，故本研究拟在前期研究的基础上从肠道菌群角度探讨针灸治疗CD的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用体质量为（140±20）g的雄性清洁级SD（Sprague-Dawley）大鼠，于上海中医药大学实验动物中心饲养。饲养条件：室温为（20±2）℃，湿度50%～70%，12 h昼夜节律交替，自由饮水。适应性饲养5 d后，将一般情况正常的大鼠纳入实验。所有动物的使用严格按照国家实验动物健康规定执行。实验过程严格遵循动物伦理学标准，动物福利伦理委员会批准通过（伦理审批号：PZSHUTCM210305005）。

1.1.2 药物 2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid，TNBS）（Sigma，美国，货号：P2297）;柳氮磺吡啶肠溶片（上海中西三维药业有限公司，国药准字H31020450）。

1.1.3 试剂与仪器 无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，货号：10009228）;电针仪（南京济生医疗科技有限公司，型号：HANS-200A）;戊巴比妥钠（Sigma，美国，货号：P3761）;全自动组织脱水机（Leica，德国，型号：APS300S）;石蜡包埋机（Leica，德国，型号：EG1160）;石蜡切片机（Leica，德国，型号：RM2235）;光学显微镜（Olympus，日本，型号：BX53）;粪便DNA提取试剂盒（TIANGEN，德国，货号：DP328）;琼脂糖（Oxoid，英国，货号：LP0028A）;紫外微量分光光度计（Thermo Electron Corporation，美国，型号：840-210600）;PCR试剂盒（Kapa biosystems，美国，货号：KK4601）;Hiseq测序仪（Illumina，美国，型号：2500）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 按照随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、隔药饼灸组、电针组和西药组，每组8只。采用TNBS灌肠液制备大鼠CD模型[10]。大鼠称重后，采用2%戊巴比妥钠（20 mg/kg）腹腔注射麻醉。TNBS灌肠液制备：将无水乙醇加双蒸水，配成50%的乙醇，然后将5%的TNBS与50%的乙醇按2∶1比例混合成TNBS灌肠液。以0.2 mL/100 g TNBS灌肠液进行灌肠;用12 cm长的灌肠针插入直肠约6～8 cm，1 mL注射器注入。每日观察大鼠的精神状态、进食、活动、大便性状等一般情况。每隔7 d重复灌肠1次，共4次。

1.2.2 干预方法 造模结束后第2天进行干预。正常组不做任何处理，模型组造模后也不做任何处理，隔药灸组和电针组造模后分别采用隔药饼灸和电针大鼠天枢（双侧）、气海穴。隔药饼灸组中药饼主要以附子、肉桂、丹参等药研末，用黄酒调和之后使用模具制成饼，厚约0.5 cm，直径1 cm，将大小约90 mg的艾炷放在药饼上置于上述穴位上施灸，每次每穴各灸2壮。电针组采用疏密波，频率2～100 Hz，电流2 mA，留针20 min。西药组采用柳氮磺吡啶溶液灌胃。剂量为：按成人（70 kg体质量）∶大鼠（200 g体质量）=1∶0.018比例根据《药理学实验方法》制备灌胃溶液。上述3个观察组大鼠均固定时间干预1次/d，共7 d。标本采集与处理治疗结束之后，采用2%戊巴比妥钠，40～50 mg/kg，腹腔注射麻醉，自肛门向上约2 cm处截取长6～8 cm的结肠，纵向剖开结肠，取出粪便放入冻存管中，于-80 ℃冰箱中保存，并将取得的结肠放入4%多聚甲醛中固定。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色法观察结肠组织病理学改变 主要步骤：结肠组织脱水、石蜡包埋、石蜡切片（厚度为4 μm），二甲苯、梯度乙醇、苏木精染色、1%盐酸乙醇、伊红染色、梯度乙醇、二甲苯、中性树胶封片，在光学显微镜下观察组织形态并进行结肠组织学评分。

1.2.3.2 大鼠肠道菌群16S rDNA高通量测序 采用16S rDNA高通量测序进行大鼠粪便样本中肠道菌群的检测（n=7）。该测序方法通过对16S rRNA基因上的可变区域进行扩增，利用可变区域的差异来对不同菌属的细菌进行分类鉴定，检测方法如下：1）样品DNA抽提：采用DNA试剂盒对大鼠粪便中的总DNA进行抽提，并采用紫外微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的浓度和质量，质控合格的DNA进入文库构建。2）文庫构建：选择V3-V4区进行扩增，并加上测序仪所需的接头、测序引物和index序列，构建文库。3）Illumina上机测序：文库构建好后，使用Illumina HiSeq2500 PE250测序平台进行上机测序，通过桥式PCR扩增生成DNA簇，检测与DNA片段结合的dNTP荧光信号获知DNA片段序列。4）生物信息分析：测序完成后，对原始数据进行质控，去除含N碱基、嵌合体的质量低等序列，用优化之后的序列进行运算分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚类，每个OTU被认为可代表一个物种。用OTU代表序列与16S数据库进行比对和物种注释，得到OTU丰度表，最后基于OTU丰度表进行后续的可视化和统计化分析。采用R语言进行数据统计分析。

1.3 统计学方法 采用R语言3.2.3（http：//cran.r-project.org）中的Kruskal-Wallis检验进行组间差异物种丰度分析。采用SPSS 21.0统计软件（IBM Co.，Armonk，NY，USA）对肠道组织病理学评分进行统计分析，服从正态分布的资料采用均数±标准差（±s）表示，而不服从正态分布的资料则采用M（P25，P75）来表示。方差齐性，组间比较采用方差分析（One-wayANOVA）中的最小显著性差异（LSD），方差不齐性，采用非参数检验中的秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠结肠组织病理学观察

光镜下显示正常组结肠黏膜结构完好，肠黏膜上皮连续覆盖，黏膜固有层腺体排列整齐，走向规则，黏膜下层为疏松结缔组织，无出血点、糜烂及溃疡;模型组结肠黏膜、黏膜下层形态结构紊乱，结肠黏膜出血，可见裂隙样溃疡，黏膜下层和肌层有大量炎症细胞浸润;隔药饼灸组结肠组织损伤程度明显减轻，黏膜层结构尚完整，可见新生的黏膜上皮修复，炎症细胞浸润和出血程度均较模型组减轻;电针组结肠黏膜、黏膜下层以及肌层结构基本正常，有新生的黏膜上皮修复和愈合性溃疡;西药组结肠组织可见新生的黏膜上皮修复、愈合性溃疡，炎症细胞浸润程度明显减少，无明显出血点。见图1。

组织病理学评分结果显示，模型组结肠组织病理学评分显著高于正常组，差异有统计学意义（P<0.01）;而隔药饼灸组、电针组和西药组结肠组织病理学评分均显著低于模型组，差异均有统计学意义（均P<0.01）。见图2。

2.2 物种注释丰度分析

根据OTU丰度表及其代表的不同物种，分别在门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）不同分类等级对各组样品做相应的物种相对丰度和比例的柱状图。在门水平包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）4种优势菌门，在属水平普雷沃菌属（Prevotella）、氏菌属（Roseburia）、拟普雷沃菌属（Alloprevotella）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）、梭菌属XIVa（Clostridium XIVa）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）等7种菌属是主要优势细菌。与正常组比较，模型组拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、拟杆菌目（Bacteroidiales）、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、普雷沃菌属（Prevotella）等的相对丰度升高，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、梭菌纲（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）等的相对丰度降低;在经过隔药饼灸、电针和西药治疗后，上述大多数微生物相對丰度均有不同程度改善，其中隔药饼灸还能增加乳酸杆菌属的相对丰度，电针还能增加瘤胃菌科的相对丰度。见图3。

2.3 针灸对CD大鼠肠道菌群alpha多样性的影响分析

alpha多样性分析用来评估单个样品中的物种多样性，主要包括Observed species指数、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数以及PD whole tree指数，其中反映群落丰富度的指数主要有Chao1和Observed species。与正常组比较，模型组Chao1和Observed species指数均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，隔药饼灸组Chao1和Observed species指数均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），电针组Chao1和Observed species指数均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），西药组Chao1和Observed species指数与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

反映群落多样性的指数主要有Shannon、Simpson和PD whole tree指数。与正常组比较，模型组Shannon、Simpson和PD whole tree指数均有一定程度的下降，Shannon、Simpson指数差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），但PD whole tree差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较，隔药饼灸组Shannon、Simpson和PD whole tree指数均有一定程度的升高，Shannon、Simpson指数差异有统计学意义（P<0.01），但PD whole tree指数差异无统计学意义（P>0.05），电针组Shannon、Simpson和PD whole tree指数均有一定程度的升高，Shannon、Simpson指数差异有统计学意义（P<0.01），但PD whole tree指数差异无统计学意义（P>0.05），西药组Shannon、Simpson指数与模型组差异无统计学意义（P>0.05），PD whole tree指数差异有统计学意义（P<0.01）。见图5。

2.4 针灸对CD大鼠肠道菌群16S功能预测代谢功能的影响

为了解CD大鼠肠道菌群代谢情况以及针灸对其调节作用，本研究采用PICRUSt（V1.0.0）软件来预测5组肠道菌群潜在代谢功能的改变。5组间共有27个京都基因和基因组百科全书（KEGG）代谢通路差异有统计学意义（P<0.05），在丰度前20的KEGG通路中，与正常组比较，膜运输、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、复制和修复、翻译等20个KEGG代谢通路中的功能基因在模型组中的相对丰度均降低;与模型组比较，上述20个KEGG代谢通路中的功能基因在隔药饼灸组、电针组和西药组中的相对丰度均增加。见图6。

3 讨论

本研究采用16S rDNA高通量测序研究CD大鼠微生物群落组成和相对丰度，以及针灸对其调节作用，结果发现CD大鼠的肠道菌群alpha多样性降低，这与以往研究结果一致[11-13]。而在经过隔药饼灸和电针治疗后，肠道菌群多样性显著升高，表明隔药饼灸和电针能在一定程度上提高CD大鼠的肠道菌群群落丰富度和多样性，改善肠道微生态。已有大量研究表明针灸能够调节肠道菌群紊乱，改善肠道菌群多样性，从而达到治疗胃肠疾病的目的[14]。课题组前期研究发现，艾灸治疗7 d可以增加结肠炎大鼠肠道菌群的多样性，提高肠道中乳酸杆菌等益生菌的数量，使结肠炎大鼠失调的肠道菌群向正常的方向转变[15]，可能是针灸治疗结肠炎的关键环节，但其具体机制尚不明确。侯天舒等[16]研究发现，电针能够改善溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群多样性，升高乳酸杆菌和毛螺科菌的相对丰度，降低双酶梭菌的相对丰度。张博等[17]采用针灸联合汤药疗法治疗溃疡性结肠炎患者，发现其能够提高肠道菌群内的乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的相对丰度，降低致病菌相对丰度。王园园[18]在对CD模型大鼠进行针刺与艾灸治疗后发现，针灸可以调节CD大鼠肠道菌群的失衡状态，改善大鼠肠道菌群的多样性及益生菌与有害菌的丰富度。

本研究发现CD大鼠肠道的优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门，这与相关文献[18]报道相似。拟杆菌门包括拟杆菌纲、黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲，其中拟杆菌纲在有些时候能够成为致病菌，在CD大鼠肠道中的相对丰度高于正常组。厚壁菌门包括梭菌纲、芽孢杆菌纲、柔膜菌纲，在大鼠肠道中占据主要优势的梭菌纲大部分都是产丁酸盐菌，瘤胃菌科也是一种产丁酸盐菌，其产生的丁酸盐具有抑制炎症反应的作用[19]，模型组梭菌纲、瘤胃菌科的相对丰度低于正常组，可能与模型组肠道炎症反应密切相关，而隔药饼灸和电针对拟杆菌纲有明显的下调作用，对梭菌纲有明显的上调作用，提示针灸治疗CD可能与调节上述细菌有关。普雷沃菌属是一种常见的条件致病菌，研究表明普雷沃菌属主要激活Toll样受体2，通过抗原呈递细胞产生IL-23、IL-1，普雷沃菌属还能刺激上皮细胞产生IL-8、IL-6和CCL20，促进黏膜Th17免疫应答和中性粒细胞募集[20]。普雷沃菌属介导的黏膜炎症导致炎症介质、细菌和细菌产物的全身传播，进而可能影响全身疾病的结局[21]。这表明某些普氏菌菌株可能是临床上重要的病原菌，可促进慢性炎症影响人类疾病的发生发展。而在本研究中，隔药饼灸和电针能够显著降低大鼠肠道中普雷沃菌属的相对丰度，表明针灸可能通过降低该菌属而对肠道黏膜起到一定修复作用。

为了解CD大鼠肠道菌群代谢情况以及针灸对其调节作用，本研究基于16S rDNA高通量测序的结果对5组大鼠肠道微生物潜在代谢功能进行预测。结果显示在L2水平，与正常组比较，碳水化合物代谢、氨基酸代谢通路中的功能基因在模型组中的相对丰度均降低;与模型组比较，碳水化合物代谢、氨基酸代谢通路中的功能基因在隔药饼灸组、电针组和西药组中的相对丰度均增加。表明CD大鼠紊乱的肠道菌群将影响碳水化合物代谢、氨基酸代谢通路，而隔药灸和电针均具有一定的调节作用。氨基酸是维持人体正常免疫能力，保护人体抵御疾病的必需物质，氨基酸及其代谢产物在促进肠道生长、维持肠道功能和腸黏膜完整性等方面发挥重要作用[22]。CD患者体内氨基酸代谢异常已被广泛报道[23-25]，这与本研究结果类似。而隔药灸和电针均能调节与氨基酸代谢相关的功能基因的丰度，从而保护肠道黏膜和肠道屏障。

综上所述，CD大鼠在门、纲、目、科、属等不同分类水平上均存在微生物组成和相对丰度的变化，而在经过隔药饼灸和电针治疗后，上述大多数微生物相对丰度均有不同程度改善。本研究除了发现隔药饼灸和电针对CD大鼠肠道菌群调节作用的共性之外，还有个性之处，例如，隔药饼灸还能增加CD大鼠乳酸杆菌属等益生菌的相对丰度，而电针则能增加CD大鼠瘤胃菌科等产丁酸盐菌的相对丰度。总结起来，隔药饼灸和电针均可以调节CD大鼠肠道菌群结构的紊乱。本研究的不足之处在于，16S rDNA高通量测序技术得到的序列大部分都注释不到属水平，今后可以应用宏基因组测序鉴定到种水平甚至菌株水平，从而更有利于阐明微生物群落在针灸治疗CD中的作用机制。

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（2022-01-06收稿 本文编辑：吴珊）