高铅血症儿童肠道菌群构成变化研究

李树然　李秋燕　彭镇委

[摘要]目的探讨高铅血症儿童肠道菌群构成的变化。方法选取2013～2014年海华社康中心儿保门诊儿童，高铅血症患儿29例，1：1配对健康对照儿童29例，检测两组儿童肠道菌群中双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和肠球菌的数量以及肠道内双歧杆菌与大肠杆菌数量对数值的比值f即B/E值）。结果与对照组相比，高铅血症患者粪便中的乳酸杆菌、双歧杆菌数量显著下降（两组P值均是0.000），大肠杆菌数量明显升高（f=11.1，P=0.000），肠球菌在两组中无统计学差异（t=0.497，P=0.623），高铅血症患儿B/E值为（0.75±0.34），显著低于健康对照组（1.21±0.36）（t=-7.5，P=0.000）。结论高铅血症患儿体内存在肠道菌群紊乱。

[关键词]儿童；高铅血症；肠道菌群；构成；变化

健康人的肠道栖息着1014个细菌，其中绝大多数为厌氧菌，主要有拟杆菌属、梭菌、乳杆菌、大肠埃希菌属和双歧杆菌属，大部分肠道细菌主要位于结肠、远端小肠，胃、十二指肠和空、回肠中也有菌群存在，肠道菌群构成了人体胃肠道的生物学屏障，在维持肠道的正常结构和生理功能上发挥着重要作用。儿童肠道菌群处于生理性演替过程中，年龄越小，其肠道的微生态平衡稳定性越差，易于发生肠道微生态紊乱。铅是一种不可降解的环境污染物。由于儿童代谢和发育的特点，在同等环境的人群中，铅对其的毒性作用更明显，尤其是对智力与行为能力的发育有重要影响。儿童通过铅污染食物及消化道接触铅，占总接触量的80%～90%以上。铅在消化道的吸收部位主要在小肠，但大肠对铅也有吸收。在吸收和排泄的过程中，铅不可避免地会与肠道菌群接触，但这二者之间的相互性未见报道。本研究通过分析高铅血症患儿的粪便中肠道菌群主要成分的菌落数变化和肠道内双歧杆菌和大肠杆菌数量对数值的比值（即B/E值），以对高铅血症与肠道菌群构成的关系进行了探讨。现报道如下。

1.资料与方法

1.1一般資料

选择2013～2014年宝安区海华社康中心儿保门诊，近期未患感染性疾病或其他疾病的儿童，年龄2～6岁。采集静脉血样，送南方医科大学基础医学院专用实验室统一用博晖BH-2100钨舟原子吸收光谱仪检测。按1991年美国国家疾病预防控制中心制定的儿童高铅血症的诊断标准，将血铅值≥100ug/L（0.483umol/L）（无论是否有相应临床体征或其他血液、生化改变）儿童，纳入高铅血症组：共29例，平均年龄（3.2±0.5）岁，男19例，女10例。为消除混杂因素的影响，采取1：1配对，选取同期参加体检的，与病例组同年龄、同性别的29例健康儿童（血铅值<100ug/L的儿童做为对照组。以上入选患儿均征得监护人同意后签订知情同意书。研究方案经医院伦理学委员会批准。

1.2肠道菌群检测

（1）无菌方法采集受试儿童新鲜粪便（1h内），80℃保存。（2）定量称取标本0.1g，予10倍系列稀释至10-1～10-9，连同原液一共10个稀释度；（3）用微量移液器抽取10uL，分别接种于MRSA、TPY、EMB、Pz选择性培养基上，用L棒涂抹均匀，用于培养乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌以及肠球菌，计数时取菌落平均数。（4）将MRSA、TPY培养基放入厌氧罐中，置于厌氧产气袋封闭，再放入37℃的孵育箱中培养48h；同时将EMB、PZ培养基直接放人37℃的孵育箱中培养24h；（5）培养结束后选取特征性的菌落进行菌落图片染色及镜检，根据革兰染色以及细菌的形态学特征判断目的菌。在确定目的菌后，根据计算平板上的活菌计数以及稀释度，用活菌计数公式计数，结果用每克粪便湿质量中的菌落形成单位的对数值表示（即log CFU/g）。每毫升标本中活菌集落单位（即CFU/mL）=（标本质量+稀释量）/标本质量×稀释度×菌落个数（或×10）（稀释度即为稀释倍数）。

1.3B/E值计算

B/E值为肠道内双歧杆菌与大肠杆菌数量对数值的比值，用来表示儿童肠道菌群构成，可以反映肠道的功能状况：B/E值<1表示肠道定植抗力降低，菌群结构发生紊乱；≥1则表示正常。

1.4统计学方法

使用SPSS20.0软件进行统计。实验中的计量资料均符合正态分布，用（x±s）表示。组问菌落数和B/E值比较使用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1高铅血症组与对照组肠道茵群数量比较

高铅血症患儿与对照组儿童的肠道菌群数量比较显示，除肠球菌外，双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌组P=0.000，差异有统计学意义。见表1。

2.2高铅血症组与健康对照组肠道菌群B/E值比较

高铅血症患儿的肠道菌群B/E值为（0.785±0.34），<1。健康对照组的B/E值为（1.2132±0.36），>1。健康对照组的B/E值高于高铅血症组（t=7.6，P=0.00）

3.讨论

研究显示，大肠与小肠一样，对铅也有吸收，而且大肠是肠道菌群寄居的主要部位，肠道菌群为宿主提供能量底物，肠道菌群紊乱可导致体内代谢混乱，从而可能影响肠道对铅的吸收。国内外对肠道菌群与人体内铅的吸收、排泄关系研究，主要如下：（1）肠道菌群发育不良动物的肠黏膜薄而干燥，肠道通透性较高，使一些原来不易进入人体循环的大分子抗原等物质能通过主动转运和被动扩散等形式穿透肠道上皮。（2）肠道菌群的稳定对维持人体正常排便机制具有重要作用，肠道菌群失调参与了便秘的产生与加重，从而引起铅的吸收增加。（3）微量元素钙、铜、铁、镁、锌等在肠道吸收时与铅共用同一部位的转运蛋白，铅一钙、铅一铁、铅锌等之间均有拮抗作用，补充钙、锌剂等能降低血铅。而肠道正常菌群如双歧杆菌可通过对碳水化合物的发酵，使短链脂肪酸产物增多，降低肠道PH值，能促进对钙、铁、镁等离子的吸收。（4）一些益生菌具有驱铅能力。芬兰学者发现乳酸杆菌、双歧杆菌菌株具有快速清除被污染水中的重金属铅和镉的能力。

在本研究中，高铅血症组患儿的双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌分别为（6.59±0.56）lg（CFU/g）、（6.73±1.05）1g（CFU/g）和（8.44±1.21）1g（CFU/g），与对照组儿童的肠道菌群数量比较显示，高铅血症组患儿的双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显减少，大肠杆菌明显上升，差异有统计学意义。这说明乳酸杆菌、双歧杆菌菌株可能具有清除被污染水中的重金属铅和镉的能力，这与芬兰学者发现一致。同时，根据学者Teemu等发现，乳酸杆菌ME3和双歧杆菌L46在人体外可通过可逆性的表面结合的方式，达到清除水溶液中的铅和镉。考虑体内的这些肠道益生菌具有和铅结合的能力，这些益生菌数量的增加能直接降低铅吸收。当然，这有待更直接的实验证据证实。

高铅血症患儿的肠道菌群B/E值<1，健康对照组的B/E值>1，结果显示高铅血症患儿B/E值显著低于健康对照组。这提示高铅血症患儿肠道定植抗力降低，肠道菌群结构发生变化。

另一方面，本实验发现高铅血症组患儿的肠球菌为（6.16±0.92）lg（CFU/g），与对照组儿童的肠球菌比较显示，数量无明显差异。这说明高铅血症患儿存在的肠道菌群紊乱主要体现在双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌的影响上，而益生菌的减少易导致儿童消化不良，导致了便秘的产生与加重。这一研究结果与高铅血症患儿往往存在便秘、不规则腹痛、轻度消化不良的临床表现现象一致。同时，便秘等导致铅在消化道停留时间延长，引起铅的吸收增加，这与Parslow的发现一致。

综上所述，本研究结果发现高铅血症患儿存在肠道菌群紊乱，且从现有线索可以推测肠道菌群影响着铅的吸收与排泄，特别是消化道双歧杆菌、乳酸杆菌的数量直接影响到消化道对铅的吸收，这提示我们可以通过增加双歧杆菌、乳酸杆菌的摄入，改善肠道菌群结构，从而治疗与防止高铅血症。