lncRNA TSIX通过靶向miR-548-a-3p抑制肝细胞癌细胞增殖和侵袭的机制研究

王佳乐 李琤 李广明

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，以往关于肝癌发病机制的研究主要集中在传统蛋白编码基因[1]。随着高通量测序技术的发展，已发现非编码RNA(ncRNA)占人类基因组的95%以上，编码RNA的蛋白质与功能性ncRNA之间的相互作用在癌症的发展过程中具有重要作用[2]。长ncRNA(lncRNA)作为ncRNA的重要组成部分，已被证明与表观遗传、基因转录、调控和翻译有关[3]。X非活性特异性转录物(XIST)是最近发现的位于染色体10q26上的lncRNA，XIST在胃癌和结肠直肠癌中发挥明显抑癌作用[4]。既往研究证实miR-548-a-3p参与了HCC，但具体机制有待进一步阐明[5]。miRNA是lncRNA发挥其生物学功能的重要靶标，生物信息学分析表明，XIST和miR-548-a-3p之间存在结合位点[6]。目前尚未见lncRNA TSIX在肝细胞癌中的研究，本研究拟探讨lncRNA TSIX通过靶向miR-548-a-3p抑制HCC细胞增殖和侵袭的机制，为HCC的治疗提供理论依据。

材料与方法

一、主要仪器与试剂

Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Thermo Fisher Scientific)，胎牛血清、青霉素、链霉素(美国Gibco)，Lipofectamine 2000(美国Thermo Fisher Scientific)，CCK-8试剂盒(美国Sigma)，WE-986.90酶标仪(美国Bio-Rad),多聚甲醛、结晶紫(中国碧云天生物科技)、SD-09倒置显微镜(日本奥林巴斯)，膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)双重染色试剂(BD Biosciences)，CV-90流式细胞仪(美国Beckman Coulter)，Matrigel膜(美国Corning)，Transwell腔室(美国BD Biosciences)，TRIzol试剂(美国Invitrogen)，逆转录试剂盒(中国塔卡拉)，SYBR-Green定量实时PCR Master Mix试剂盒(日本Toyobo)，Tween-20细胞裂解缓冲液(中国碧云天生物科技)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，美国Sigma)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF，美国赛默飞世)，1%牛血清白蛋白(BSA，上海生工)。

二、细胞培养及其分组设计

Huh7细胞从美国典型培养物保藏中心获得，并在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养 (含有10%的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的链霉素)，并在在37 ℃、5%CO2的湿润气氛中生长。

lncRNA TSIX mimics组、lncRNA TSIX inhibitor组培养方法：载体包括lncRNA TSIX过表达载体(lncRNA TSIX mimics)，lncRNA TSIX低表达载体(lncRNA TSIX inhibitor组)购自Ribo Bio Co，Ltd(中国广州)。根据制造商的建议，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen，Carlsbad，美国)对载体进行转染，48 h后收集细胞并进行处理以进行进一步的体外研究。

三、Huh7细胞活力的检测及癌细胞单克隆形成数目检测

使用MTT试剂盒测量细胞增殖，将细胞在96孔板中培养，并在细胞孔中加入20 μL MTT试剂(5 mg/mL)。在37 ℃下孵育4 h后，将MTT替换为150 μL DMSO，并将平板缓慢振摇10 min，通过酶标仪在570 nm下测定每个吸光度。

通过胰蛋白酶消化收集接受不同处理后的细胞，并以1 000个细胞/孔的密度铺在6孔板上。培养14 d后，将细胞用10%甲醛固定，然后用0.1%结晶紫染色10 min，在光学显微镜下计数菌落数。

四、Huh7细胞凋亡测定

Annexin V-FITC / PI双重染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡。将转染的细胞以3×105细胞/孔的密度接种在6孔板中，用0.25%胰蛋白酶消化，消化后用PBS洗涤两次，加入100 μL结合缓冲液，依次制成1×106细胞/mL悬浮液。加入膜联蛋白V-FITC和PI，在室温下于黑暗中孵育5 min，并用FC500MCL流式细胞仪系统检测。重复实验3次并取平均值。

五、Huh7细胞迁移水平测定

使用Matrigel Tranwell评估细胞侵袭水平，将经过不同处理的细胞重新悬浮在无FBS的RMPI-1640培养基中，并铺在上腔室的transwell插入物上。而下腔室则装有含有20%FBS的RMPI-1640培养基。进一步培养24 h后，将侵袭和迁移的细胞用10%甲醛固定，并用0.1%结晶紫染色10 min。通过在光学显微镜下随机选择五个视野来量化侵袭细胞的数量。

六、Huh7细胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表达水平测定

首先，将细胞系制备成细胞悬液。然后，添加TRIzol试剂以提取总RNA。用紫外分光光度计测试提取的总RNA的纯度和浓度。使用SYBR-Green Realtime PCR Master mix用miR-26a-5p和HMGA2反转录总RNA。操作步骤严格按照制造商的工具包进行。然后，进行PCR扩增实验。 PCR反应系统如下：cDNA 1 μL，上，下游引物0.4 μL，2×SYBRr-Green Realtime PCR Master mix 10 μL，被动参考染料(50×)0.4 μL，ddH2O添加至20 μL。lncRNA TSIX的PCR反应条件如下：在94 ℃预变性45 s，在94 ℃变性10 s，在60 ℃退火30 s，共40个循环。实验以U6作为内部参照进行了3次。miR-548-a-3p反应条件如下：在94 ℃变性10s，在60 ℃退火30 s，共40个循环。实验以β-肌动蛋白为内参进行了3次。lncRNA TSIX、miR-548-a-3p的特异性引物如下：lncRNA TSIX，正向5-GCACAGGTTAGCGTG-TTTCC-3，反向5-CCCAGTTTCCCAGAGGTCAC-3； miR-548-a-3p，forward5-AACACACCTTTAC-AAGGATTCA-3。β-肌动蛋白，上游序列：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游序列：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

七、统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行分析，定量实验数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析比较，多重比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、各组Huh7细胞OD值、存活率比较

由表1可见，lncRNA TSIX mimics组OD值、存活率低于Huh7细胞组(t=8.725、5.437，P<0.05)，lncRNA TSIX inhibitor组OD值、存活率高于Huh7细胞组和lncRNA TSIX mimics组(t=4.124、3.784、10.462、7.965，P<0.05)。

二、各组Huh7细胞单克隆形成数目、凋亡率及穿膜数比较

由表2及图1、图2可见，lncRNA TSIX mimics组单克隆形成数目、穿膜数低于Huh7细胞组，凋亡率高于Huh7细胞组(t=120.834、64.321、10.531，P<0.05)；lncRNA TSIX inhibitor组单克隆形成数目、穿膜数高于Huh7细胞组和lncRNA TSIX mimics组，凋亡率低于Huh7细胞组和lncRNA TSIX mimics组(t=37.192、174.632、30.703、104.562、37.385、48.021，P<0.05)。

表1 各组Huh7细胞OD值、存活率比较

表2 各组Huh7细胞克隆形成数目、凋亡率及穿膜数比较

图1 各组Huh7细胞凋亡流式细胞图

A: Huh7细胞组；B: lncRNA TSIX mimics组；C: lncRNA TSIX inhibitor组

三、各组Huh7细胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表达水平比较

由表3可见，lncRNA TSIX mimics组lncRNA TSIX高于Huh7细胞组，miR-548-a-3p低于Huh7细胞组(t=12.372、11.265，P<0.05)，lncRNA TSIX inhibitor组lncRNA TSIX低于Huh7细胞组和lncRNA TSIX mimics组，miR-548-a-3p高于Huh7细胞组和lncRNA TSIX mimics组(t=4.618、9.597、6.612、10.058，P<0.05)。

讨 论

具有功能性的lncRNA的异常表达与肝癌的发生、发展以及侵袭性生物学行为密切相关。例如，在人肝癌组织和细胞中，lncRNA转移相关的肺腺癌转录本1(MALAT1)一直增加，这可能成为肝癌的有效生物标志物[7]。在本研究中，lncRNA TSIX mimics组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数低于Huh7细胞组，lncRNA TSIX inhibitor组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数高于Huh7细胞组、lncRNA TSIX mimics组(P<0.05)。lncRNA TSIX mimics组凋亡率高于Huh7细胞组，lncRNA TSIX inhibitor组凋亡率低于Huh7细胞组、lncRNA TSIX mimics组(P<0.05)。这说明lncRNA TSIX参与了肝癌的发病和发展，并可明显抑制HCC细胞增殖、侵袭，促进HCC细胞凋亡。 lncRNA TSIX已被证明在几种人类肿瘤中低表达，并在肿瘤发生和发展中起着抑癌作用[8-9]。在临床研究中，已经观察到人肝癌组织中lncRNA TSIX表达的显著下调，这与其在其他肿瘤中的表达谱一致[10-11]。本研究假设具有癌抑制作用的lncRNA TSIX在HCC中起一定的作用，并且通过观察HCC细胞的生物行为学进一步证实了这一结论。

为了进一步探索肝癌中lncRNA TSIX的精确调控过程，根据已发表的研究和生物信息学分析，推断miR-548-a-3p可能是lncRNA TSIX的下游靶标。新兴研究表明，miRNA属于ncRNA，在人类HCC中也起着至关重要的作用，包括miR-548-a-3p[12]。miR-548-a-3p在肝癌组织和血清中上调，促进细胞生长，与患者预后不良有关[13]。lncRNA对miRNA的直接或间接调节是发挥其生物学功能的重要机制之一。生物信息学分析表明，lncRNA TSIX可能通过碱基配对相互作用与miR-548-a-3p结合，表明它们之间的功能相关性[14]。与lncRNA TSIX相反，临床研究观察到miR-548-a-3p在HCC组织和细胞中显著增加[15]。有趣的是，在肝癌组织中，lncRNA TSIX的表达与miR-548-a-3p呈显著负相关，表明它们之间存在相互调节的关系。体外实验证实，lncRNA TSIX负调控miR-548-a-3p的表达，这可能取决于直接组合，但具体机制尚待进一步研究。本研究中，lncRNA TSIX mimics组lncRNA TSIX 高于Huh7细胞组，miR-548-a-3p 低于Huh7细胞组(P<0.05)；lncRNA TSIX inhibitor组lncRNA TSIX 低于Huh7细胞组、lncRNA TSIX mimics组，miR-548-a-3p高于Huh7细胞组、lncRNA TSIX mimics组(P<0.05)。这说明，lncRNA TSIX的上调过表达逆转了miR-548-a-3p在体外对HCC细胞的生长促进作用。本文数据证明，lncRNA TSIX诱导的HCC生长抑制至少部分由负调节miR-548-a-3p介导。

表3 各组Huh7细胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表达水平比较

综上所述，lncRNA TSIX明显抑制HCC细胞增殖、侵袭，促进HCC细胞凋亡；其机制可能与lncRNA TSIX负调节miR-548-a-3p有关。