RNA结合蛋白CSTF2通过调控MCM6促进HCC细胞的增殖和迁移

何晓燕 张强弩 宰国真 杨柳 王桂芝

肝癌是全球发病率第六位的恶性肿瘤，同时也是全球第四位的癌症致死病因[1]。原发性肝癌的85%～95%是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，由于起病隐匿加之早期诊断措施不够完善，HCC中晚期患者的死亡率高达80%，中位生存期不足1年、5年生存率不足20%[2]。因此，有必要进一步探索HCC的分子机制，找到与HCC相关的关键分子，从而助力于HCC早期诊断、治疗靶点的确定、患者的个体化治疗及预后判断。

RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBP)是参与转录后调控事件的重要蛋白，凭借多变的RNA-binding区域和灵活的结构，RBP以动态的形式控制了很多RNA的代谢行为，包括RNA的剪接、定位、转运及稳定性维持[3-4]。目前，已经明确RBP可以通过转录后调控等作用参与肿瘤的发生发展。研究已经证实，癌组织和癌旁组织中存在一些RBP的表达差异，并且这种差异表达与患者的预后及临床特征相关，这些证据提示RBP可能作为肿瘤治疗的重要靶点[5]。切割刺激因子(cleavage stimulation factor 2，CSTF2)是RBP的一种，它可以结合靶基因mRNA的3'非翻译区(3’-UTR)内的富含GU的元件，对3’-UTR进行修剪，从而使靶基因的表达和活性出现变化[6]。但是在HCC中，CSTF2的作用还不清楚。本研究发现CSTF2在HCC中呈现高表达，高表达的CSTF2预示着患者的不良预后。在体外细胞试验中，笔者对CSTF2的功能进行了研究，发现CSTF2在体外具有促癌作用。同时本研究发现CSTF2与微小染色体维持蛋白6(minichromosome maintenance complex component 6，MCM6)具有表达上的相关性，因此在分子机制方面笔者假设HCC中CSTF2可能通过调控MCM6发挥作用。体外细胞试验表明，CSTF2确实可以增加MCM6表达，并通过MCM6促进HCC细胞的增殖和转移。综上，本研究表明CSTF2具有成为HCC分子治疗靶点的潜力。

材料和方法

一、主要试剂

Huh7肝癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院；胰酶及胎牛血清购自美国GIBCO公司； Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis反转录试剂盒及Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix荧光定量PCR试剂盒购自上海翊圣生物公司；Lipofectamine 2000及 Lipofectamine RNAiMax购自美国Thermo Fisher公司；CCK-8细胞活力试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒RIPA裂解液和ECL发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。引物由广州金唯智公司提供，siRNA-MCM6购自由广州锐博生物公司；siRNA阴性对照购自美国Qiagen公司。

二、公共数据收集

9个不同中心的HCC队列mRNA微芯片数据(GSE14520, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE45436, GSE64041, GSE76427, GSE54236及GSE63898)集通过Gene Expression Omnibus数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索并下载。2个中心的HCC队列RNA测序数据(TCGA-LIHC及ICGC-LIRI-JP)通过Integrative Molecular Database of Hepatocellular Carcinoma(HCCDB，http://47.95.203.196/database/hccdb/home.html)数据库检索并下载。各队列癌组织和癌周组织的mRNA表达差异使用R软件及Limma程序包进行分析。

三、临床样本和免疫组织化学染色

收集20例在接受治疗并进行手术切除的HCC癌组织和对应癌周组织的石蜡包埋组织样本。所有病例均经过病理学确诊，其中男性患者15例，女性患者5例。包埋组织切片后进行免疫组织化学染色，一抗使用兔抗人多克隆CSTF2抗体(1∶150)，二抗使用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔lgG抗体。辣根过氧化物酶显色试剂盒进行显示处理后，评估癌组织和癌周组织的CSTF2阳性率。

四、细胞培养及细胞转染

肝细胞癌Huh7细胞常规培养于37 ℃、5% CO2培养箱。培养基采用含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基。取对数期细胞进行试验。CSTF2的上调采用体外转染pcDNA3.1-CSTF2过表达质粒的方式实现，同时采用pcDNA3.1空质粒作为阴性转染对照。MCM6的下调采用转染siRNA-MCM6的方式实现，采用All star®无关序列作为阴性转染对照。质粒的转染采用Lipofectamine 2000试剂，同时siRNA的转染采用Lipofectamine RNAiMax试剂。

五、CCK-8细胞活力试验

将转染好的细胞按照每孔3 000个的密度种植于96孔板后继续培养24 h。待细胞贴壁后(设定为0 h点)，使用CCK-8细胞活力试剂盒检测0、24、48及72 h各组细胞的活力变化。检测时弃去培养孔原有培养基，每孔加入100 μL CCK-8试剂(1∶10)，37 ℃放置 1 h后测量450 nm处吸光度。按照公式(增殖率=其他时间点吸光度/0时间点吸光度)计算各组细胞的增殖情况。

六、划痕试验

将转染好的细胞按照每孔100 000个的密度种植于12孔板后继续培养24 h。待细胞贴壁后使用无菌的移液器吸头进行划痕，划痕后立即在倒置显微镜下进行拍照。继续培养48 h后再次进行拍照。Image J软件(版本号1.53)计算各时间点的划痕面积，比较各组的细胞迁移速度。

七、实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)

各组样本的总RNA样本通过TRIzol®试剂进行提取。使用Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis反转录试剂盒对获取的总RNA样本进行反转录以获取cDNA模板。使用Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix荧光定量PCR试剂盒对获取的cDNA进行定量扩增，内参使用GAPDH。兴趣基因的相对表达水平采用2-△△CT法计算，其中△CT=CT目标-CT内参。CSTF2的引物序列为上游：5′-TCACTGCGTT-CCGTGTTCG-3′，下游：5′- CCCTTGGGTTTTC-CCGTCTC-3′。MCM6的引物序列为上游：5′-GA-GGAACTGATTCGTCCTGAGA-3′，下游：5′-CA-AGGCCCGACACAGGTAAG-3′。GAPDH的引物序列为上游：5′- TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游：5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

八、Western blot分析

使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取各组细胞样本的总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒对蛋白样本定量后与5X上样缓冲液进行混合，使用聚丙烯酰胺凝胶对对蛋白样本进行电泳分离，将蛋白印迹转移到醋酸纤维薄膜。5% 脱脂奶粉室温封闭2 h。兔抗人CSTF2、MCM6及GAPDH (内参)多克隆抗体进行一抗孵育，过夜后，PBST洗涤膜3遍，进行辣根过氧化物酶标记的羊抗兔lgG二抗孵育2 h。ECL化学发光色后进行条带检测。

九、统计学分析

结 果

一、CSTF2在肝癌组织中的表达特点

笔者首先收集了9个不同中心HCC队列的mRNA微芯片数据以及2个中心HCC队列的mRNA测序数据。通过比较这些数据集中癌组织和癌周组织的mRNA表达差异，发现在这些队列的HCC患者癌组织中CSTF2的mRNA均呈现高表达(P<0.05)。CSTF2的mRNA在各队列中的表达情况见图1A。免疫组织化学提示CSTF2在HCC癌组织中呈现高表达(图1B)，其中在癌组织中的阳性表达率为75%，在癌周组织中仅为30%，差异具有统计学意义(P<0.05)。

A.CSTF2 mRNA在9个HCC mRNA芯片数据集和2个测序数据集中的表达情况；B.免疫组织化学染色检测CSTF2在HCC患者癌组织和癌周正常组织中的表达×100

二、CSTF2与肝癌患者临床病理特征及预后的关系

接下来笔者将TCGA-LIHC数据集中的患者以及GSE14520数据集中的患者按照CSTF2 mRNA的水平中位值进行了分组，并且比较了两组患者之间的临床病例特征(表1和表2)。CSTF2表达水平与HCC患者的肿瘤尺寸、AFP水平、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期及侵袭风险密切相关(P<0.05)。在TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP队列中，较高的CSTF2表达水平(以mRNA水平的中位值为截断值)预示着较差的总体生存率(P<0.05,图2A-B)。在GSE14520中，可以发现在早期CSTF2水平似乎与患者生存率无关，但是在中晚期，较高CSTF2水平的患者总体生存率较低(图2C)。在TCGA-LIHC队列中较高的CSTF2水平预示着较低的无病生存率(图2D)。

表1 TCGA-LIHC数据集中CSTF2 mRNA水平与患者临床特征的关系

表2 GSE14520数据集中CSTF2 mRNA水平与患者临床特征的关系

三、肝癌细胞中CSTF2通过调控MCM6的表达发挥对HCC细胞的增殖和迁移促进作用

基于HCCDB数据库的整合，HCC队列的共表达分析提示MCM6与CSTF2存在共表达关系(图3A)。笔者在9个HCC队列的mRNA微芯片数据以及2个中心HCC队列的mRNA测序数据中对CSTF2和MCM6的mRNA表达情况作了相关性分析，结果发现除GSE63898外，在其他队列的癌组织中CSTF2均与MCM6的表达存在显著的正相关性(图3B)。

A.TCGA-LIHC数据集中CSTF2 mRNA水平与患者总体生存率的关系；B.ICGC-LIRI-JP数据集中CSTF2 mRNA水平与患者总体生存率的关系；C.GSE14520数据集中CSTF2 mRNA水平与患者总体生存率的关系；D.TCGA-LIHC数据集中CSTF2 mRNA水平与患者无病生存率的关系

A.以CSTF2为核心的的基因共表达网络；B.11个HCC数据集中肝癌组织内的CSTF2 mRNA水平与MCM6 mRNA水平的相关性；C.转染CSTF2过表达质粒的Huh7细胞中CSTF2及MCM6的mRNA变化；D.转染CSTF2过表达质粒的Huh7细胞中CSTF2及MCM6的mRNA变化。*表示与pcDNA3.1空质粒转染的细胞相比，P<0.05

在Huh7细胞中，转染表达pcDNA3.1-CSTF2质粒可以有效提高CSTF2的表达水平，同时可以观察到CSTF2过表达后，细胞MCM6 mRNA和蛋白水平也出现增加(图3C及图3D)。过表达CSTF2后，笔者发现Huh7细胞的增殖加快(图4A)，同时转移能力也加强(图4B)。转染MCM6的siRNA后，可见CSTF2的促增殖和促迁移效果被抵消(图4A-4B)。siRNA-MCM6效敲减细胞的MCM6 mRNA及蛋白表达的效果见图4C及图4D。

A.转染CSTF2及siRNA-MCM6后Huh7细胞的增殖能力变化；B.转染CSTF2及siRNA-MCM6后Huh7细胞的迁移能力变化；C.siRNA-MCM6转染有效降低Huh7细胞的MCM6 mRNA水平D.siRNA-MCM6转染有效降低Huh7细胞的MCM6 蛋白水平。*表示与阴性转染混合物(pcDNA3.1空质粒+Allstar阴性转染对照)或Allstar阴性转染对照的细胞相比，P<0.05

讨 论

RNA结合蛋白可以结合促癌基因或抑癌基因的RNA从而调控这些基因RNA的剪接、定位、转运及稳定性，从而参与促癌基因和抑癌基因RNA的动态平衡[7]。RNA结合蛋白的表达和功能异常会打破抑癌基因和促癌基因的动态平衡，最终导致肿瘤的发生发展。因此，探讨RBP与肿瘤发生的关系及其分子作用机制，对发现新的肿瘤标志物或者潜在的分子治疗靶点意义重大。HCC是全球范围内死亡率极高的恶性肿瘤之一，治疗效果及预后极差。既往的一些研究揭示了RBP与HCC的关系。比如Zhao等[8]发现了42个与HCC进展相关的RBP，其中RPS3在肝癌组织中的丰度较高。进一步的研究发现，RPS3可以通过与SIRT1的RNA结合，从而稳定SIRT1的RNA表达，而SIRT1具有促癌作用。因此通过这个机制RPS3发挥促进HCC的作用。Yang等[9]报道了另一个RBP PTBP3在HCC的作用，他们的研究发现，PTBP3可以调控NEAT1和pre-miR-612的RNA剪切平衡从而促进HCC的增殖和转移。

然而，大多数RBP在HCC进展中的生物学功能和机制尚不清楚，更多与HCC有关的RBP需要被鉴定并进行深入研究。基于这个需求，笔者在前期工作中收集了9个不同中心HCC队列的mRNA微芯片数据进行了秩聚合算法的整合，共涉及病例1 000余例。通过对上述大数据的整合和挖掘笔者鉴定到了34个RBP在肝癌组织和癌周组织间存在显著的表达差异，其中包括CSTF2。本研究发现，CSTF2在11个中心(9个芯片数据集和2个测序数据集)的HCC数据集中都呈现出在肝癌组织中的过表达，提示CSTF2在HCC中可能扮演一定的角色。但是目前还没有任何研究报道CSTF2在HCC中的作用和机制。不过已经有少量证据提示CSTF2在其他肿瘤中的作用，并且这些证据都提示CSTF2具有促癌作用，机制可能为CSTF2对其靶基因RNA 3’-UTR的结合剪切作用使得这些基因的3’-UTR缩短，从而使得靶基因的表达或活性发生了变化。比如Chen等[10]发现膀胱癌细胞中CSTF2可以与RAC1的3’-UTR结合，从而导致RAC1的3’-UTR区域缩短，使得RAC1不能和一些microRNA结合，间接导致RAC1的mRNA水平增加。通过这个机制CSTF2在膀胱癌发挥促癌作用，同时高CSTF2和其引起的一些靶基因的3’-UTR区域缩短可能成为膀胱癌患者的预后较差的标志物。Akman等[11]的研究指出，在乳腺癌中EGF能够引起CSTF2的上调，后者可以引起大量增殖相关靶基因的3’-UTR缩短事件。

本研究首先探讨了CSTF2的表达水平和HCC患者预后及其他临床特征的关系。基于公共大数据的mRNA表达谱及相关临床数据，笔者发现较高的CSTF2 mRNA预示着较差的HCC患者预后，且较高CSTF2 mRNA水平的HCC患者出现较大肿瘤尺寸、较高AFP水平、较晚TNM分期及血管侵袭的比例较高。在蛋白水平，笔者通过免疫组化分析发现CSTF2的蛋白水平在癌组织中明显升高，来自human protein atlas数据库的免疫组化结果与笔者的数据一致，也提示CSTF2在癌组织中呈现高表达。这些证据提示CSTF2在HCC中可能发挥促癌作用。接着在体外细胞试验中笔者对CSTF2的功能进行了验证，发现过表达CSTF2后，肝癌Huh7细胞的增殖加快且迁移速度加快，这提示CSTF2在HCC中的确具有促癌作用。接着笔者尝试找到HCC中受CSTF2调控的靶基因，通过基于多个HCC队列的相关性分析发现MCM6与CSTF2在HCC癌组织中具有较强的相关性，因此MCM6很可能受CSTF2的调控。MCM6是参与DNA复制启动的重要因子，它与其他5个MCM蛋白家族的成员形成聚合物后可以启动DNA的复制，从而参与肿瘤细胞的增殖，较高的MCM6表达提示增殖活跃。MCM6的促癌作用已经在HCC得到了报道，比如Liu等[12]的研究发现MCM6可以促进HCC细胞的S/G2比例，从而增加增殖，提示患者的不良预后。另一项研究则表明，MCM6通过MEK/ERK通路促进HCC的转移[13]。但是MCM6的上游调控机制还未见有报道，MCM6在HCC中增高的原因仍然需要探讨。在体外细胞研究中，笔者发现在高表达CSTF2后，MCM6的mRNA和蛋白表达均出现了上调，提示CSTF2能够增加MCM6的表达。在过表达CSTF2的同时敲减MCM6的表达，可以观察到CSTF2的促癌作用减弱了，提示CSTF2的促癌作用部分是通过MCM6实现的。基于既往报道的CSTF2 RNA结合功能，本研究推测CSTF2可能是通过缩短MCM6的3’-UTR，从而导致MCM6不被一些microRNA降解，间接引起MCM6的表达增高。这一假设需要在后期研究中进行验证。

总之，本研究发现CSTF2在HCC的癌组织中存在显著的过表达并预示着患者的不良预后；CSTF2可能通过调控MCM6的表达来发挥促进HCC细胞增殖和迁移的作用；CSTF2和MCM6有望成为HCC诊断的分子标志物或者治疗的分子靶点。