不同马传染性贫血病毒株编码的S2 蛋白拮抗SERINC5 分子机理的研究

李荣荣，李苏楠，Iqbal Ahmad，郑永辉

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室-美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

天然免疫是机体对抗外来微生物感染的第一道防线，宿主细胞抵御病毒侵入而产生的抗病毒分子又称宿主限制性因子[1]。丝氨酸整合因子5（Serine incorporator 5，Ser5）是近来发现的宿主限制因子，将其通过未知机制插入人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）粒子中并抑制病毒将其侵入下一个靶细胞，而HIV-1 编码的Nef 蛋白能拮抗Ser5 的抗病毒活性[2]。研究发现HIV-1 Nef蛋白能将Ser5 内化至细胞浆中并通过溶酶体途径降解Ser5，进而阻止Ser5 进入新生病毒粒子中[3]。除了HIV-1 Nef 蛋白之外，鼠白血病病毒（Murine leukemia virus，MLV）的附属蛋白glycoGag以及马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）的附属蛋白S2 也能通过相似的机制拮抗Ser5 对HIV-1 感染的限制作用[4]。然而，不同HIV-1病毒株编码的Nef蛋白拮抗Ser5的能力和具体机制不尽相同。

马传染性贫血（Equine infectious anemia，EIA）是新中国成立以来严重危害养马业的重要传染病之一，EIA 的病原EIAV 是一种复杂的逆转录病毒，能够编码多种附属蛋白调控病毒的复制[5]。S2 是EIAV特有的附属蛋白，S2 的缺失会显著降低病毒在体内的复制水平和致病力[6]。美国Wyoming 强毒株是一种对马属动物高度致死的EIAV，EIAVpv 是Wyoming 株体外培养的适应株，对马属动物具有感染性，但无致病性[7]。pSPEIAV19（No. GU385359.1）（命名为EIAV）是在EIAVpv 株感染的马肾源细胞中获得的非致病感染性克隆株，有研究发现高致病性EIAV Wyoming株或者致病性EIAVpv 变异株的3'端替换pSPEIAV19对应的位置，可恢复该感染性克隆株的致病性[8]。这些研究结果提示影响病毒毒力的区域可能位于病毒基因组的3'端（包括env 和LTR）[9]。通过对非致病感染性克隆株EIAV 研究发现其长期体外传代后丧失了毒力，从而制备了中国EIAV 弱毒疫苗株（No. U01866.1）（命名为EIAVHRBS2），已证明其可有效控制EIA 的流行[10]。王雪峰等人对EIAV 弱毒疫苗亲本株EIAVLN40感染马后连续分离病毒并测序发现，EIAV 基因组在马体内的进化过程中高度变异，呈现明显的正选择压力[11]。作为本实验的研究对象，EIAV 和EIAVHRBS2在核苷酸和推导氨基酸水平上，S2的差异分别为2.5%～4.1%和6.4%～10.6%，具有3 个共有氨基酸取代位点（T41I、T51I、Q55K），说明EIAVHRBS2株S2 中的3 个共有突变残基对该病毒相关毒力蛋白的功能至关重要[12]。

本实验室前期研究发现EIAVS2编码的S2 蛋白（命名为S2 蛋白）通过受体介导的内吞机制内化细胞膜表面的Ser5，并在核内体的帮助下将Ser5 转运到溶酶体后降解，进而拮抗Ser5 的抗病毒活性[13]。然而，EIAVHRBS2编码的S2 蛋白（命名为HRB-S2 蛋白）是否也能拮抗Ser5 的抗病毒活性？二者在机制上是否有区别？目前还不清楚。基于此，本研究将重点探究HRB-S2 蛋白如何拮抗Ser5 的抗病毒活性，试图揭示不同EIAV 编码的S2 蛋白拮抗Ser5 的机制差异，以期对抗HIV-1 药物的开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料人胚胎肾细胞293T、人宫颈癌细胞Hela 和TZM-bl 细胞（HIV-1 感染后表达荧光素酶，其活性高低与HIV-1 感染性呈正相关）均由本实验室保存；质粒pBJ5-iFLAG-Ser5、pCMV6-Ser5-FLAG、pEGFP-Ser5、pcDNA3.1-Ser5-VN-HA、pcDNA3.1-Ser5-FLAG-VC、pcDNA3.1-S2-HA、pcDNA3.1-glycoMA-HA、pcDNA3.1-Nef-HA、pcDNA3.1-S2-VN-HA、pcDNA3.1-S2-FLAG-VC、pcDNA3.1-AP-μ1-V5-VC、pcDNA3.1-AP-2α-V5-VC、pcDNA3.1-AP-2σ-V5-VC、DsRed-Rab7 和DsRed-Rab11 以及沉默质粒shAP-2σ、shRab7 和shRab11 均由本实验室前期制备并保存[14]；HIV-1 野生型（HIV-1 WT）、HIV-1 Nef 缺失型（HIV-1 ΔNef）及HIV-1 Env 质粒均由Kenzo Tokunaga 惠赠；本实验室前期将密码子优化后的HRB S2 基因分别克隆至相应载体构建重组质粒pcDNA3.1-HRB-S2-HA、pcDNA3.1-HRB-S2-VN-HA 和pcDNA3.1-HRB-S2-FLAG-VC 并保存；另外本实验室前期分别对pcDNA3.1-HRB-S2-HA 和pcDNA3.1-HRB-S2-VN-HA 质粒中的HRB-S2 进行点突变，获得了G2A、E22A 和L26A 突变体质粒并保存备用；RIPA 裂解液、 ERAD 通路抑制剂DBeQ、自噬通路抑制剂Wortmannin、泛素蛋白酶体通路抑制剂MG132、溶酶体通路抑制剂Bafilomycin A1、鼠源HA 抗体和鼠源FLAG 抗体均购自Sigma 公司；NH4Cl 由本实验室配制；聚乙烯亚胺转染试剂（Polyethylenimin，PEI）购自Polyscience 公司；Lipofectamine®3000（Lip3000）转染试剂、antiHA-HRP 和Monoclonal ANTI-FLAG（R）M2-Peroxidase（HRP）antibody（antiFLAG-HRP）均购自Thermo 公司；antiActin-HRP 购自武汉三鹰公司；兔源V5 抗体、Alexa-Fluor-647 标记的羊抗鼠IgG、Alexa-Fluor-488 标记的羊抗鼠IgG 均购自Invitrogen 公司；兔源Rab7 和Rab11 抗体购自Cell Signaling Technology。

1.2 HRB-S2 对Ser5 抗病毒活性影响的检测利用PEI转染试剂分别转染HIV-1 WT（1 μg）+HIV-1 Env（0.5 μg）和HIV-1 ΔNef（1 μg）+ HIV-1 Env（0.5 μg）的质粒于293T 细胞中，用于包装HIV-1、HIV-1 ΔNef两组伪病毒，同时分别于上述两组细胞中转染pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）、pcDNA3.1-S2-HA（3 μg）、pcDNA3.1-glycoMA-HA（3 μg）、pcDNA3.1-Nef-HA（3 μg）和pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）质粒，其中转染pcDNA3.1-glycoMA-HA 和pcDNA3.1-Nef-HA 组作为本实验的阳性对照。转染48 h 后收集含HIV-1、HIV-1 ΔNef 两组伪病毒上清，通过ELISA 方法对病毒粒子含量进行测定。同时取HIV-1、HIV-1 ΔNef两组伪病毒上清分别感染TZM-bl 细胞，感染48 h 后使用多功能酶标仪检测TZM-bl 细胞荧光素酶活性（即luc 值），计算Luc/ELISA 的比值得到HIV-1 伪病毒的相对感染性，以检测HRB-S2 对Ser5 抗病毒活性的影响。

1.3 HRB-S2 对Ser5 表达及细胞内定位影响的检测使用PEI 转染试剂将pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-S2-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-glycoMA-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-Nef-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）质粒分别转染293T 细胞，转染24 h 后收集细胞，用预冷的RIPA 裂解液裂解细胞提取细胞蛋白，分别以antiActin-HRP（1∶20 000）、antiHA-HRP（1∶2 000）和anti-FLAG-HRP（1∶20 000）为抗体进行孵育，通过western blot 检测Ser5、S2、Nef、glycoMA 和HRB-S2 蛋白的表达，其中检测Nef、glycoMA 作为阳性对照，分析HRB-S2 蛋白对Ser5 的降解情况。为了检测HRB-S2 和Ser5 在细胞内的定位情况，利用Lip3000将pEGFP-Ser5（1 μg）和pEGFP-Ser5（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分别转染Hela 细胞，转染24 h 后以Anti-HA（1∶1 000）为一抗，Alexa-Fluor-647 标记的山羊抗鼠IgG（1∶500）为二抗，经DAPI 染核，利用高分辨率活细胞共聚焦显微镜观察具有绿色荧光活性的Ser5 蛋白和具有红色荧光活性的HRB-S2 蛋白的定位情况。

1.4 HRB-S2 降解Ser5 蛋白关键位点的检测利用PEI 转染试剂将质粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-G2A-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-E22AHA（3 μg）和pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-L26A-HA（3 μg）分别转染293T 细胞，24 h后用预冷的RIPA 裂解液裂解细胞提取细胞蛋白，按照1.3 中western blot 方法检测Ser5 和HRB-S2 及其突变体蛋白表达情况，确定HRB-S2 降解Ser5 蛋白的关键位点。研究发现可以将Venus 蛋白（具有绿色荧光活性）分成两部分， 分别为N 端和C 端，N 端为aa2～aa173 区域（VN）， C 端为aa154～aa238区域（VC），当单独存在VN 或者VC 时，荧光分子没有绿光；当VN 和VC 同时存在并足够靠近时，荧光分子活性恢复发出绿色荧光（图3A）[15]。本研究根据该原理进行双分子荧光互补实验（BimolecuLar Fluores- cence Complementation，BiFC）：使用Lip3000将质粒pcDNA3.1-Ser5-FLAG-VC（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-VN-HA（3 μg）、pcDNA3.1-Ser5-FLAG-VC（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-G2A-HA（3 μg）、pcDNA3.1- Ser5- FLAG- VC（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-E22A-HA（3 μg）和pcDNA3.1-Ser5-FLAG-VC（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-L26A-HA（3 μg）分别转染Hela 细胞24 h 后，按照1.3 中方法检测Ser5 蛋白和HRB-S2及其突变体蛋白在细胞内的分布和共定位情况。

1.5 受体介导的内吞对HRB-S2 降解Ser5 影响的检测使用PEI 转染试剂将质粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分别与APμ1-V5-VC（1 μg）、AP-2α-V5-VC（1 μg）和AP-2σ-V5-VC（1 μg）共转染293T 细胞24 h 后，用预冷的RIPA 裂解液裂解细胞提取细胞蛋白，按照1.3 方法通过western blot 检测Ser5 和HRB-S2、AP-μ1、AP-2α、AP-2σ 蛋白的表达，评估AP-μ1、AP-2α、AP-2σ 蛋白对HRB-S2 降解Ser5 的影响。使用PEI转染试剂将质粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）+shAP-2σ（4 μg）转染293T细胞，其中沉默质粒shAP-2σ 转染细胞后能够特异性降解AP-2σ 的mRNA 导致AP-2σ 基因表达沉默，24 h 后用预冷的RIPA 裂解液裂解细胞后提取细胞蛋白，按照1.3 中western blot 方法检测Ser5、HRB-S2和Actin 蛋白的表达，评估shAP-2σ 沉默AP-2σ 后对HRB-S2 降解Ser5 的影响。利用Lip3000 将质粒pBJ5-iFLAG-Ser5（2 μg）和pBJ5-iFLAG-Ser5（2 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分别转染两组Hela 细胞，转染24 h 后两组细胞用Anti-FLAG（1∶1 000）4 ℃孵育30 mins，接着将一组样品在37 ℃孵育1 h使Ser5 发生内吞，另一组在4 ℃孵育1 h 阻止内吞，以Anti-FLAG（1∶2 000）为一抗，其余抗体种类及浓度按照1.3 中激光共聚焦试验进行，观察具有绿色荧光活性Ser5 蛋白的定位情况，以检测在受体作用下HRB-S2 对Ser5 降解的影响。

1.6 Rab7 和Rab11 对HRB-S2 降解Ser5 影响的检测使用PEI 转染试剂将质粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分别与DsRed-Rab7（3 μg）和DsRed-Rab11（3 μg）共转染293T 细胞，转染24 h 后用预冷的RIPA 裂解液裂解细胞提取细胞蛋白，按照1.3 中western blot 方法检测Ser5、HRB-S2、Rab7、Rab11 和Actin 蛋白的表达情况，确定Rab7 和Rab11 对HRB-S2 降解Ser5 的影响。使用PEI 转染试剂将pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分别与shRab7（4 μg）和shRAb11（4 μg）共转染293T 细胞24 h 后用预冷的RIPA 裂解液裂解细胞后提取细胞蛋白，分别以Anti-Rab7，Anti-Rab11（1∶5 000）为一抗，其余抗体种类及浓度参照1.3 中western blot 方法，检测Ser5 和Actin 蛋白的表达，评估沉默Rab7 和RAb11 表达后对HRBS2 降解Ser5 的影响。

1.7 不同EIAV编码的S2蛋白对Ser5蛋白降解影响的检测分别利用Lip3000和PEI转染试剂将Ser5-FLAGVC（1 μg）+Ser5-VN-HA（1 μg）、S2-FLAG-VC（1 μg）+S2-VN-HA（1 μg）和HRB-S2-FLAG-VC（1 μg）+HRBS2-VN-HA（1 μg）分别共转染Hela 细胞和293T 细胞，转染24 h 后对Hela 细胞按照1.3 方法处理样品，通过激光共聚焦观察绿色荧光（S2-FLAG-VC+S2-VN-HA 和HRB-S2-FLAG-VC+HRB-S2-VN-HA形成二聚体的情况）和红色荧光（S2 和HRB-S2 蛋白）共定位的情况；转染24 h 后对收集293T 细胞并固定，封闭，以Anti-FLAG（1∶1 000）为一抗，Alexa-Fluor-488 标记的羊抗鼠IgG（1∶500）为二抗，通过流式细胞术检测平均荧光强度（MFI）以确定S2和HRB-S2 蛋白形成二聚体的情况。为了进一步确定HRB-S2 降解Ser5 蛋白的降解途径，使用PEI转染试剂分别将质粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-S2-HA（3 μg）共转染293T 细胞，转染6 h 换液，12 h 后分别加入DBeQ（15 μmol/L）、Wortmannin（100 nmol/L）、MG132（10 μmol/L）、NH4Cl（20 μmol/L）和Bafilomycin A1（100 nmol/L）蛋白降解通路抑制剂继续培养12 h 后用预冷的RIPA裂解液裂解细胞后提取细胞蛋白，按照1.3中western blot方法检测Ser5、HRB-S2 和Actin 蛋白表达情况，确定HRBS2降解Ser5蛋白的降解途径。

1.8 统计学分析本研究使用SPSS 软件对所有实验数据进行配对双尾t检验统计学分析。所有试验至少重复3次，结果以±s表示。*：P＜0.05，表示差异显著；**：P＜0.01，***：P＜0.001表示差异极显著。

2 结 果

2.1 HRB-S2 对Ser5 抗病毒活性影响的检测结果利用HIV-1 WT和HIV-1 ΔNef质粒转染293T细胞包装两种伪病毒，同时过表达Ser5、glycoMA、Nef、S2、HRB-S2 蛋白，通过ELISA 检测病毒上清中两组伪病毒粒子的含量，同时将含两组伪病毒上清感染TZM-bl靶细胞获得荧光素酶的活性值（Luc值），计算Luc/ELISA的比值得到HIV-1 WT和HIV-1 ΔNef两组伪病毒的相对感染性，以评估HRB-S2 对Ser5 抗病毒活性的影响。结果显示HIV-1 WT 和HIV-1 ΔNef 在无Ser5时，HIV-1 WT感染性大于HIV-1 ΔNef；在过表达Ser5蛋白时，Ser5能够抑制HIV-1的感染性，尤其是在Nef缺失的情况下抑制HIV-1的感染性更显著；而Nef、glycoMA、S2 和HRB-S2 均能极显著拮抗Ser5 的抗病毒活性（P＜0.001），其中S2 拮抗Ser5 的能力比HRB-S2更强（图1）。表明HRB-S2能够拮抗Ser5的抗病毒活性。

图1 HRB-S2对Ser5抗病毒活性的影响Fig.1 The effect of HRB-S2 on the antiviral activity of Ser5

2.2 HRB-S2 对Ser5 表达及细胞内定位影响的检测结果将pCMV6-Ser5-FLAG 和pcDNA3.1-HRBS2-HA 质粒共转染293T 细胞，通过western blot 检测Ser5 蛋白的表达，评估HRB-S2 对Ser5 降解的影响。结果显示，与对照组相比，Nef、glycoMA、S2、HRBS2 均能显著降解Ser5 蛋白表达，其中HRB-S2 和Nef降解Ser5 的能力比S2 和glycoMA 弱（图2A）。利用Lip3000 将pEGFP-Ser5 和pcDNA3.1-HRB-S2-VN-HA分别单独和共转染Hela 细胞，激光共聚焦观察可见，单独转染pEGFP-Ser5 组，Ser5 在细胞膜表面有绿色荧光，表明Ser5 分布于细胞膜；共转染pEGFPSer5+HRB-S2-HA 组，Ser5 和HRB-S2 在细胞浆内存在绿色和红色荧光的共定位情况，表明HRB-S2 能够将Ser5 从细胞膜表面转运至细胞浆（图2B）。以上结果表明HRB-S2 下调细胞膜表面Ser5 的表达。

图2 HRB-S2对Ser5表达及细胞内定位的影响Fig.2 The effect of HRB-S2 on Ser5 degradation and cellular localization

2.3 HRB-S2降解Ser5蛋白关键位点的检测结果将质粒pCMV6-Ser5-FLAG 与pcDNA3.1-HRB-S2-HA 及其G2A、E22A 和L26A 突变体共转染293T 细胞， western blot 检测结果显示，HRB-S2-WT 能够显著降解Ser5 蛋白，这与2.2 结果一致；而HRB-S2 L26A 降解Ser5 蛋白的能力减弱，表明L26是降解Ser5 蛋白的关键位点（图3B）；同时利用激光共聚焦检测HRB-S2及突变体蛋白与Ser5 在细胞内定位情况，结果显示HRB-S2 与Ser5 在细胞浆存在共定位，而HRB-S2 L26A 和Ser5在细胞膜有共定位（图3C），表明L26A不能下调细胞膜表面的Ser5。以上结果表明L26是HRB-S2转运降解Ser5 蛋白的关键氨基酸位点。

图3 HRB-S2降解Ser5蛋白的关键位点的检测Fig.3 Detection of the key site of HRB-S2 degradation of Ser5

2.4 受体介导的内吞对HRB-S2 降解Ser5 影响的检测结果将质粒pCMV6-Ser5-FLAG+pcDNA3.1-HRB-S2-HA 分别与pcDNA3.1-AP-μ1-V5-VC、pcDNA3.1-AP-2α-V5-VC 和pcDNA3.1-AP-2σ-V5-VC 共转染293T细胞，通过western blot检测Ser5蛋白的表达水平，以确定AP-μ1、AP-2α、AP-2σ蛋白对HRB-S2降解Ser5 的影响。结果显示，仅AP-2σ 能显著促进HRB-S2 对Ser5 的降解（图4A、4B）；将质粒pCMV6-Ser5-FLAG+pcDNA3.1-HRB-S2-HA+shAP-2σ 共转染293T 细胞，通过western blot 检测Ser5 蛋白的表达水平，确定shAP-2σ沉默AP-2σ 后对HRB-S2 降解Ser5的影响，结果显示利用shRNA 沉默AP-2σ 表达后，HRB-S2 不能降解Ser5 蛋白的表达（图4C），表明AP-2σ 参与HRB-S2 对Ser5 的降解过程。在温度依赖的内吞试验中，已知在4 ℃条件下细胞代谢停止，细胞内吞活动被抑制。通过激光共聚焦观察可见，与4 ℃相比，在37 ℃时HRB-S2 显著促进Ser5的内吞（图4D）。这些结果表明HRB-S2 通过受体介导的内吞机制内化Ser5 蛋白。

图4 受体介导的内吞对HRB-S2降解Ser5的影响Fig.4 The effect of receptor-mediated endocytosis on HRB-S2 degradation of Ser5

2.5 Rab7 和Rab11 对HRB-S2 降解Ser5 影响的检测结果过表达Ser5、HRB-S2 和Rab7、Rab11 蛋白后通过western blot 检测在HRB-S2、Rab7、Rab11 作用下Ser5 的蛋白表达，以确定Rab7 和Rab11 对HRB-S2 降解Ser5 影响，结果显示Rab7 和Rab11 存在条件下，HRB-S2 降解Ser5 的能力增强（图5A），表明Rab7 和Rab11 能促进HRB-S2 降解Ser5；另外过表达Ser5、HRB-S2 和shRab7、shRab11 质粒，通过western blot 检测Ser5 蛋白的表达，确定沉默Rab7 和RAb11 蛋白对HRB-S2 降解Ser5 影响，结果显示沉默Rab7 和Rab11 后HRB-S2 降解Ser5 能力明显减弱（图5B）。以上结果表明Rab7和Rab11参与HRB-S2 降解Ser5 的过程。

图5 Rab7和Rab11对HRB-S2降解Ser5影响的western blot检测Fig.5 The effect of Rab7 and Rab11 degradation of Ser5 in the presence of HRB-S2

2.6 不同EIAV 编码的S2 蛋白对Ser5 降解影响的检测结果利用BiFC 技术，将Ser5-FLAG-VC+Ser5-VN-HA、S2-FLAG-VC+S2-VN-HA 和HRB-S2-FLAGVC+HRB-S2-VN-HA 分别共转染Hela 细胞和293T 细胞，通过激光共聚焦观察Hela 细胞组绿色荧光，结果显示HRB-S2 和Ser5 均存在二聚体，而S2 不会形成二聚体（图6A）；通过流式细胞术检测293T 细胞组，结果显示HRB-S2 的平均绿色荧光强度（MFI）明显高于S2，表明HRB-S2 存在二聚体，而S2 不存在二聚体（图6B）。在检测HRB-S2 降解Ser5 蛋白的降解途径试验中，过表达Ser5 和HRB-S2 蛋白12 h 后分别加入多种蛋白降解通路抑制剂阻止蛋白降解，通过western blot 检测Ser5 蛋白的表达以确定HRB-S2降解Ser5 蛋白的降解途径，结果显示，NH4Cl 和Bafilomycin A1 显著抑制HRB-S2 和S2 对Ser5 的降解作用（图6C）；此外，MG132 显著抑制HRB-S2 对Ser5的降解作用，并增加HRB-S2 的表达，而对S2 无影响（图6C、6D），表明HRB-S2 通过蛋白酶体和溶酶体途径降解Ser5。上述结果表明HRB-S2 蛋白能够形成二聚体，并通过蛋白酶体和溶酶体途径降解Ser5 蛋白。

图6 不同EIAV编码的S2蛋白对Ser5降解的影响的检测Fig.6 The effect of different EIAV S2 on Ser5 degradation

3 讨 论

Ser5 是新近发现的在不同物种间高度保守的宿主限制因子，能抑制逆转录病毒HIV-1、鼠白血病病毒（MLV）、EIAV 的感染性，而病毒附属蛋白Nef、gycoMA 和S2 能拮抗Ser5 的抗病毒活性[15]。本研究发现，EIAVHRBS2编码的HRB-S2 蛋白也能拮抗Ser5 的抗病毒活性，并且HRB-S2 蛋白能显著降低Ser5 的表达，但是HRB-S2 蛋白降解Ser5 的能力明显比S2 弱。通过对HRB-S2 蛋白进行点突变，发现L26是其降解Ser5 的关键氨基酸位点，这与本团队前期研究结果一致[13]。通过比较不同病毒株的S2 蛋白发现，L26是比较保守，虽然来自不同病毒株的S2 蛋白序列存在差异，导致不同S2 蛋白的功能有所不同，但本研究证实该保守位点在S2 拮抗Ser5 抗病毒活性中发挥重要作用。

本实验室前期研究结果证明Nef、glycoMA 和S2通过受体介导的内吞内化Ser5，并将Ser5 靶向到溶酶体进行降解[13]。S2 具有一个功能性N 末端肉豆蔻酰化位点，S2 和Se5 之间的相互作用依赖于该豆蔻酰化位点，并可与质膜结合，由此推测S2 和Se5 的相互作用发生在细胞膜上。研究表明S2 与质膜上的Ser5 存在相互作用，并通过AP-2 介导的内吞作用下调Ser5[16]。S2 将Ser5 重新定位到Rab5 早期、Rab7 晚期和Rab11 循环核内体中[13]。本研究发现HRB-S2 蛋白也能通过AP-2σ 将Ser5 内化至Rab7 和Rab11 内体中。由此可以看出，尽管不同病毒附属蛋白拮抗Ser5 的能力存在差异，但逆转录病毒如HIV-1、EIAV 和MLV 等已经进化出类似的机制来拮抗宿主Ser5 的病毒限制作用。

BiFC 试验结果表明HRB-S2 蛋白能形成二聚体。本实验室前期研究结果表明Nef 之间存在二聚体形式，而glycoMA 和S2 蛋白却不能形成二聚体[4]。本研究通过western blot试验发现，Nef和HRB-S2蛋白降解Ser5 的能力明显比S2 蛋白和glycoMA 弱，结合相关研究推测病毒因子形成二聚体可能会影响其拮抗Ser5的能力[17]。本研究进一步通过使用不同降解通路的特异性抑制剂研究发现，HRB-S2 蛋白不仅通过溶酶体途径降解Ser5，还能通过蛋白酶体通路降解Ser5，然而与S2 相比，蛋白酶体通路的特异性抑制剂还能阻止HRB-S2 蛋白的降解。根据这些结果推测形成二聚体构象的HRB-S2 蛋白本身可以通过蛋白酶体途径降解，导致能与Ser5 结合的HRB-S2 蛋白减少，这可能是HRB-S2 蛋白拮抗Ser5 抗病毒活性能力比S2 蛋白弱的原因之一，但这一推论需要进一步验证。

本研究结果显示HRB-S2 通过AP-2 介导的内吞将Ser5 从细胞膜表面转运至细胞浆中，在Rab7 和Rab11 的参与下将Ser5 转运至溶酶体和蛋白酶体进行降解，从而拮抗Ser5 的抗病毒活性。在本实验室前期研究的基础上，本研究发现S2 和HRB-S2 蛋白均能通过降解宿主Ser5 蛋白而拮抗其抗病毒活性，然而S2 拮抗Ser5 的能力比HRB-S2 强，且HRB-S2存在二聚体化蛋白构象，S2 则没有。推测这可能是HRB-S2 拮抗Ser5 的能力比S2 弱的原因之一。本研究首次阐述了HRB-S2 蛋白拮抗Ser5 抗病毒活性能力及机制，为新型抗病毒药物的研发奠定了基础。