超高效液相色谱－串联质谱法同时检测人血清中4种内源性皮质激素

张 凡，于智睿，李明珠，乔 斌*

（1.天津大学 化工学院，天津 300350；2.天津海关工业产品安全技术中心，天津 300308）

皮质激素是一类具有21个碳原子（孕烷）的化合物，分为糖皮质激素和盐皮质激素。人体内以皮质醇（F）、皮质酮（CORT）、可的松（COR）和醛固酮（ALD）最为常见［1－2］，虽其含量极低，却在调节免疫系统、应激反应等生理活动中起着至关重要的作用，是内分泌、生理和病理学诊断的重要参考依据［3－4］。如临床上通过检测血清中F评估肾上腺功能不全病症，早晨血清中F水平低于30 ng/mL可诊断为肾上腺功能不全，血清中F水平低于50 ng/mL可排除库欣综合症［5］。血清中COR与F的比率反映了F向COR的总转化，可用于评估11β-羟基类固醇脱氢酶的活性［6－7］。

高灵敏的超高效液相色谱－三重四极杆质谱联用法（UPLC－MS/MS）在小分子临床诊断中具有诸多优势，但血清等生物样本中由于含有大量严重影响目标物分离和电离效率的内源性大分子（如蛋白质、脂质等）及小分子干扰物，未经复杂的样品前处理不能直接进行质谱检测［5－6］。目前，常用的生物样本前处理方法有固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）和蛋白沉淀（PPT）等方法［8－12］。随着技术发展，近年还出现了超声波辅助提取、蛋白盐析、分散液液萃取、超分子萃取等新型前处理方法［7，13－14］。每种前处理技术均有优缺点，前处理的选择应综合考虑分析物的理化性质、基质特性、样品预处理时间、可靠性以及成本等因素，有时需多种方法结合进行［15－16］。由于血清中皮质激素含量低且化学结构非常相似，如何建立特异性强、灵敏度高的人体内皮质激素检测方法是目前临床生化分析检测面临的挑战，迫切需要开发一种快速、灵敏的血清中皮质激素的样品前处理及分析方法。

本文针对肾上腺内分泌疾病常见检测指标，以人血清中ALD、F、CORT、COR 4种内源性皮质激素作为研究对象，采取蛋白盐析沉淀－液液萃取（PPT－LLE）相结合的血清样品前处理方法，建立同位素内标稀释法结合UPLC－MS/MS的皮质激素分析方法。通过进行前处理、色谱、质谱等条件的优化和方法学验证，以满足临床检测高通量和高灵敏度的要求，为临床对皮质激素的定量监测、内分泌疾病以及与肾上腺有关疾病的诊断、人类机体调控机能和疾病的发病机制、药物代谢等研究提供助力。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo TQ－XS三重四极杆串联质谱仪（美国Waters公司）；MS 3 basic涡旋混合仪（德国IKA公司）；离心机（德国Eppendorf公司）；氮吹仪（艾杰尔科技有限公司）；万分之一天平（德国赛多利斯仪器公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm，美国Waters公司）。

甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；25%氨水（质谱纯，阿拉丁试剂有限公司）；ALD、F、CORT、COR标准品（上海源叶生物科技有限公司），内标物F－D4、ALD－D7、CORT－D4、COR－D7（美国Iso Sciences）；叔丁基甲基醚（色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司）；乙酸乙酯、二氯甲烷（色谱纯，天津康科德科技有限公司）；硫酸锌（优级纯，天津元立化工有限公司）；实验用水为Milli Q超纯水。

血清样品来自天津市某医院门诊及住院患者，样本的收集及使用已取得医院许可并符合相关规定，患者血清样本共27例，外观澄清，无溶血、黄疸及脂血，于－80℃冷冻保存。

1.2 标准溶液的配制

皮质激素标准储备液（1 mg/mL）：准确称取ALD、F、CORT、COR对照品10.0 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶中；皮质激素标准工作液（1 ng/mL）：准确量取皮质激素标准储备液1 mL，用空白血清稀释为1 ng/mL皮质激素标准样本；同位素内标储备液（100 ng/mL）：准确量取F－D4、ALD－D7、CORT－D4、COR－D7母液（100μg/mL）10μL于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容。

标准溶液均置于－20℃保存，备用。

1.3 样品前处理

准确移取100μL血清于1.5 mL离心管中，分别加入10μL内标溶液、5μL 0.3 mol/L的硫酸锌溶液以及1 000μL叔丁基甲基醚。涡旋振荡5 min，9 000 r/min离心1 min，使蛋白完全沉淀。取800μL上清液，氮吹至干后，用100μL 50%的甲醇水溶液复溶，待上机检测。

1.4 UPLC－MS/MS的测定条件

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm），柱温30℃，流速0.3 mL/min，进样量2μL。流动相组成：A相：0.01 mmol/L氨水，B相：乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，40%B；0.5～3.0 min，40%～95%B；3.0～4.0 min，95%B；4.0～4.1 min，95%～40%B；4.1～5.0 min，40%B。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正负离子快速切换扫描模式（CORT、F、COR为ESI+模式，ALD为ESI－模式），毛细管电压：3.0 kV（ESI+）、1.0 kV（ESI－）；锥孔电压：35 V（ESI+）、25 V（ESI－），锥孔气流量：150 L/h，离子源温度：150℃，脱溶剂气温度：600℃，脱溶剂气流量：1 000 L/h，碰撞气流速：0.18 mL/min；雾化气压力：0.7 MPa。采用多离子反应监控（MRM）扫描方式，各化合物的离子对参数如表1所示。

表1 4种皮质激素的质谱参数Table 1 MS parameters of four corticosteroids

2 结果与讨论

2.1 色谱－质谱条件的优化

在ESI电离模式下，以自动调谐的方式同时对100 ng/mL CORT、F、COR、ALD以及同位素混合标准品进行质谱参数优化，确定信号响应较高的电离条件及MRM参数，优化结果见表1。

优化选择ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）色谱柱，以氨水－乙腈体系进行梯度分离，比较了不同浓度（0、0.01、0.1、1 mmol/L）氨水对目标物色谱响应的影响。结果显示，低浓度的NH4+可促进［M+H］+的产生，使皮质激素的质谱响应呈增大趋势，但当氨水浓度超过1 mmol/L时，过高的氨水浓度抑制了［M+H］+离子的形成，CORT和COR呈信号抑制现象。实验选择0.01 mmol/L氨水－乙腈作为最佳流动相。同时对流速、色谱柱温度等条件进行优化，最终确定“1.4”色谱条件。利用优化的色谱－质谱条件对1 ng/mL皮质激素和同位素内标进样检测，各化合物的MRM色谱图见图1（色谱峰数值依次为保留时间、色谱峰面积），结果显示信号良好、分离度高。

图1 皮质激素在MRM模式下的子离子色谱图Fig.1 Product ion chromatograms of corticosteroids under MRM mode

2.2 前处理条件的优化

2.2.1提取溶剂的选择

提取溶剂选择是人血清样品处理的关键。理想的人血清样本中皮质激素的提取溶剂需与样品基质具有良好的相溶性，对目标物的溶解度高，对其他干扰杂质的溶解度小，且需具有一定的脱蛋白能力，才能有效释放目标组分。皮质激素的样品前处理常规采用LLE法，通过对比乙酸乙酯、二氯甲烷和叔丁基甲基醚对皮质激素的提取效率（如图2A），显示叔丁基甲基醚的提取效率最高，从而确定其为第一提取剂。

2.2.2沉淀剂的选择

采用LLE和PPT结合对样品前处理进行优化，以叔丁基甲基醚为第一提取剂，考察其分别与沉淀剂乙酸乙酯、二氯甲烷和硫酸锌进行不同组合时，对血清中4种皮质激素提取效率的影响（见图2B）。结果显示，硫酸锌－叔丁基甲基醚对皮质激素的提取效率最高，且高于叔丁基甲基醚单独提取，这是由于血清样品的基质复杂，存在大量脂质、无机盐、蛋白质等化合物，硫酸锌的加入具有沉淀蛋白的作用，使得目标化合物能够被有效释放。此外，盐析蛋白沉淀剂还可以改善溶剂的提取环境，提高皮质激素的萃取效率。因此，综合4种皮质激素在血清中的提取效果，实验选择叔丁基甲基醚－硫酸锌作为最佳提取溶剂。

图2 不同萃取剂（A），及不同萃取剂与沉淀剂组合（B）对血清中4种皮质激素提取效率的影响Fig.2 Effects of different extractants（A），and combinations of extractants and precipitants（B）on extraction efficiencies of four corticosteroids in serum

2.2.3提取剂与沉淀剂体积的优化

提取剂体积对人血清皮质激素的提取效率有较大影响，如果体积过小，则提取不完全，导致目标物的提取回收率降低；如果提取剂体积过大，则造成有机溶剂浪费，且加长氮气吹干时间。对不同体积（400、600、800、1 000、1 200μL）叔丁基甲基醚提取剂的影响进行考察。结果显示，当叔丁基甲基醚为1 000μL时，皮质激素的提取效率最高，CORT、COR、F和ALD的提取效率分别为87.8%、72.7%、79.5%和70.2%，继续增加叔丁基甲基醚体积，提取效率无明显增长。因此，选择叔丁基甲基醚的最佳体积为1 000μL。

进一步考察不同盐析蛋白沉淀剂体积（0、5、10、15、20μL）对血清中皮质激素提取效率的影响。结果显示，硫酸锌溶液体积为5μL时提取效果最好，CORT、COR、F和ALD的提取效率分别为87.8%、81.6%、79.5%和70.2%。实验最终确定以5μL 0.3 mol/L硫酸锌溶液以及1 000μL叔丁基甲基醚相结合的盐析蛋白沉淀－液液萃取前处理方法。

2.3 方法学验证

2.3.1基质效应

通过比较空白血清提取液加标后的响应值和纯标准品溶液的响应值确定基质效应强度和评价基质效应。按照公式ME（%）=B/A×100%进行绝对基质效应计算，ME为85%～115%时表明为无基质效应，小于85%或大于115%时表明存在离子抑制或离子增强作用。实验以50%甲醇－水作为溶剂，配制不同质量浓度（0.1、1.0、10.0 ng/mL）皮质激素标准溶液，测得皮质激素色谱峰面积（A）。对空白血清按照“1.3”进行前处理操作，氮吹至干，分别加入0.1、1.0、10.0 ng/mL皮质激素标准溶液，上机检测，测得皮质激素色谱峰面积（B），每质量浓度平行测定3次。结果显示，不同质量浓度皮质激素质控样本的基质效应为85.9%～108%，表明血清样本经前处理后能显著降低基质效应，在可接受无基质效应范围内，满足检测要求。平行样本间的相对标准偏差（RSD）不大于11%，表明方法具有较高的重现性。

表2 血清中皮质激素检测的基质效应Table 2 Matrix effects of corticosteroids in serum

2.3.2线性关系、检出限与定量下限

采用空白血清配制含1 ng/mL同位素内标的一系列皮质激素标准工作液（0.05、0.02、0.01、0.005 ng/mL）。经样品前处理后上机检测，测得ALD的定量下限（S/N=10）为50 pg/mL，检出限（S/N=3）为20 pg/mL，其他3种目标物的定量下限均为20 pg/mL，检出限为10 pg/mL，方法具有较高灵敏度。以皮质激素的峰面积与内标物的峰面积比值为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标进行拟合，构建4种皮质激素的校正曲线。得到ALD的线性范围为0.05～20 ng/mL，回归方程为y=0.267 1x+3.303 4；F、CORT和COR的线性范围为0.02～20 ng/mL，回归方程分别为y=0.053 2x+2.459 2、y=0.095 8x+0.824 9、y=0.619 4x+20.738 4。4种皮质激素的线性相关系数（r2）均大于0.995。

2.3.3回收率与相对标准偏差

回收率包括提取回收率和方法回收率，表示分析方法从生物基质中提取分析物的效率，常用于评估样品制备方法从生物基质中提取分析物的能力。

2.3.3.1提取回收率与相对标准偏差用空白血清配制含1 ng/mL同位素内标的血清皮质激素质控样本（0.1、1.0、10.0 ng/mL），对样本进行前处理并上机检测（n=3），测得色谱峰面积A。用50%甲醇水溶液配制含1 ng/mL同位素内标的皮质激素标准品（0.1、1.0、10.0 ng/mL），上机检测（n=3），测得色谱峰面积B。根据公式：R=A/B×100%计算得到样本提取回收率。连续3日内重复提取回收率实验，进行日间相对标准偏差考察。结果显示，皮质激素的提取回收率为55.5%～90.8%，内标回收率均在60%以上，目标物与内标的提取回收率相近，且日内RSD和日间RSD分别不大于13%和18%（见表3），表明该前处理方法具有良好的提取效果和重复性。

表3 提取回收率的实验结果Table 3 Results of extraction recovery

2.3.3.2方法回收率与相对标准偏差方法回收率（R R）通过计算各浓度点质量控制（QC）样品的平均实测浓度（xˉ）与标示浓度S（QC样品的理论浓度）的比值获得，即R R=xˉ/S×100%。以空白血清配制含1 ng/mL同位素内标皮质激素标准样本（20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005 ng/mL），对样本进行前处理并上机检测，绘制标准曲线。取含有1 ng/mL同位素内标的血清皮质激素质量控制样本（0.1、1.0、10.0 ng/mL），按照标准曲线制备方法得到相应的测定浓度，计算方法回收率。结果显示，3种质量浓度质控样本的方法回收率为91.0%～101%。方法的日内RSD为0.40%～12%，日间RSD为2.6%～13%。表明方法具有良好的准确度和精密度（见表4）。

表4 方法回收率的实验结果Table 4 Results of method recovery

2.4 实际血清样品的检测

采用本方法对27例真实健康人血清样品进行检测，4种内源性皮质激素均有检出（表5）。结果显示，27例人血清中CORT、COR、F、ALD的质量浓度分别为0.73～8.41 ng/mL、10.91～19.62 ng/mL、100.41～319.12 ng/mL和10.18～236.57 pg/mL。由于成年人血清中CORT的正常值范围为0.53～15.60 ng/mL［17－18］，COR为7.2～59 ng/mL［19］，总F水平为50～250 ng/mL［20］，ALD为10～210 pg/mL［21］，本方法所测27例人血清样品中皮质激素的含量多数处于正常值范围。本方法准确可靠，可用于实际样品的检测。

表5 健康人血清中皮质激素的测定结果Table 5 Determination results of corticosteroids in healthy human serum

3 结 论

本文建立了蛋白沉淀－液液萃取前处理，UPLC－MS/MS检测血清样品中内源性皮质激素的分析方法。该方法无需衍生化和复杂步骤，易于实现高通量处理，且以同位素做内标，提高了方法的准确度、特异性及灵敏度。该方法具有较高的实用性，可用于临床血清样本中内源性皮质激素的检测。