多孔有机笼毛细管电色谱手性柱的研究

禹紫云，唐明华，章俊辉，袁黎明

（云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500）

毛细管电泳（CE）是微柱分离和经典电泳技术相结合的产物，是近年来的研究热点［1］。而毛细管电色谱（CEC）是结合CE［2］与高效液相色谱（HPLC）的优点而发展起来的一种高效快捷的分离手段。固定相［3－6］是色谱柱中最核心的部分，在分离过程中，CEC的固定相不仅起着保留待测物的作用，还会产生电渗流对样品进行分离。通常采用外层涂敷聚酰亚胺、内径25～100μm的熔融石英管柱［7］制作色谱柱。毛细管因具有电阻大、内径小、比表面积大等特点，使得CEC可在微电流、高电压的环境下工作［8］，并被广泛用于环境分析、药物分析、手性分离等诸多前沿领域。

多孔有机笼（POC）［9－10］是一种具有三维空腔结构的依靠分子间堆积组装通过亚胺键、碳碳键、硼酸酯键等共价键连接而成的多孔材料。该多孔材料的形状一般为四面体、八面体、十二面体和球形。用于合成多孔有机笼的反应较多，其中，席夫碱反应因不需要使用价格高昂的催化剂，且属于动态共价化学反应，易形成稳定有序的多孔材料［11－12］，被广泛运用与研究［13－14］。用伯胺与醛或者酮发生席夫碱反应容易获得有机分子胺笼，且氨基较为活泼，为后期衍生、将多孔有机笼功能化提供了多种可能性。但亚胺键不稳定，易发生水解（尤其是在酸性或碱性环境下），因此其应用受到限制。为了解决这一问题，Cooper等［15］通过一种合成策略，将多孔有机笼的顶点与含羰基的物质结合在一起，以此来维持晶体的稳定性，使其孔隙大小不发生改变。与金属有机骨架［16－19］、介孔二氧化硅［20－22］等多孔材料不同的是，POC的溶解性较好，在常见的大部分有机溶剂中均能溶解，故POC可以作为固定相用于制备色谱柱。2016年，本课题组将CC9用做气相色谱的固定相［23］，发现涂敷了CC9的色谱柱具有很好的选择性、较高分离度和良好的重现性，且其拆分外消旋体的效果与CC3－R色谱柱互补。

本文基于（1R，2R）-二苯乙二胺与2-羟基-1，3，5-均苯三甲醛之间的席夫碱缩合反应制备了一种羟基官能团化的多孔有机分子笼，其在大多数有机溶剂中具有良好的溶解性，可用作开管毛细管电色谱（OT－CEC）手性固定相。本研究将该POC均匀涂敷在毛细管壁上制成色谱柱，通过拆分位置异构体和外消旋体来研究其分离性能。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

苯酚（99%）、三氟乙酸（99%）、硫脲（99%）、六亚甲基四胺（99%）和（1R，2R）-二苯乙二胺（98%）购于上海Adamas－beta试剂有限公司；三氯甲烷（99%）、盐酸（37%）、二甲亚砜（99%）、磷酸（85%）、氢氧化钠（99%）、二氯甲烷（99.5%）购于天津风船化学试剂有限公司；二氢黄酮（99%）、酮洛芬（99%）购于比利时Acros Organics公司；o，m，p-硝基苯酚（99%）、o，m，p-硝基苯胺（99%）购于上海Aladdin试剂有限公司；生物缓冲剂三羟基氨基甲烷（Tris，99.9%）购于北京Solarbio公司。

所有手性样品的分离均在CL 1020高效毛细管电泳仪（北京华阳利民仪器有限公司）上进行，该仪器配备的紫外检测器检测波长为190～700 nm。

1.2 2-羟基-1，3，5-均苯三甲醛的合成

在2.96 g（28 mmol）苯酚与8.6 g（61 mmol）六亚甲基四胺混合物中加入30 mL三氟乙酸，并在N2保护下于130℃油浴中搅拌24 h，随后将反应升温至150℃搅拌2.5 h，接着降温至120℃，加入50 mL浓度为4 mol/L的HCl，静置12 h后，可获得淡黄色粉末，用甲醇、1 mol/L HCl、二氯甲烷洗涤，得到2-羟基-1，3，5-均苯三甲醛。

1.3 多孔有机笼的合成

根据文献［24］方法合成多孔有机笼材料：将0.159 g（0.75 mmol）（1R，2R）-二苯乙二胺加入二甲亚砜与高纯水（9∶1，体积比）的混合液中，超声使其充分溶解，然后加入0.089 g（0.5 mmol）2-羟基-1，3，5-均苯三甲醛于室温下反应14 d。反应结束后可获得黄色沉淀，依次用三氯甲烷、水洗涤，干燥处理后得到黄色粉末。

1.4 多孔有机笼开管柱制备

将熔融石英毛细管壁依次用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl和高纯水进行粗糙化处理，烘干备用。POC溶解于二氯甲烷溶液中，超声后过滤。用流速恒定的高纯氮气将上述滤液推入粗糙化后的毛细管内，用较小流速的氮气将色谱柱吹干。

1.5 毛细管电色谱实验条件

本实验选用的缓冲溶液为Tris－H3PO4，电渗流标记物为硫脲。截取一段POC开管毛细管色谱柱（58 cm×75μm），在距末端6 cm处开窗，色谱柱的有效分离长度为52 cm。初次使用该色谱柱之前，依次用去离子水、缓冲溶液冲洗色谱柱直至基线稳定。实验过程中，样品的紫外检测波长均为254 nm。

2 结果与讨论

2.1 POC晶体的表征

2.1.1X射线表征采用X射线衍射法（XRD）探究POC晶体粉末的内部结构，其特征衍射峰（图1）与文献［24］报道一致。

图1 POC晶体粉末的XRD衍射图Fig.1 XRD diffraction pattern of POC crystal powder

2.1.21H NMR谱图将POC溶于氘代氯仿（CDCl3）中测得的1H NMR谱图见图2：1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ8.92－8.86（m，4 H），8.66－8.58（m，4 H），8.42－8.39（m，4 H），8.30－8.18（m，8 H），7.22－7.06（m，6 H），4.83－4.65（m，12 H）ppm。

图2 POC的核磁共振氢谱图Fig.2 1H NMR spectrum of POC

2.1.3红外光谱图采用KBr压片法测得的POC晶体的红外光谱图见图3。可以看到，1 636 cm-1处较强的特征吸收峰为亚胺键（C==N）拉伸带，位于3 061 cm-1和2 868 cm－1处的峰为N==C―H和C―H拉伸带，位于3 420 cm-1处的吸收峰是―OH拉伸带，在约3 033、1 602、1 489、1 458 cm-1处的吸收峰由苯环中C==C―H和C==C的拉伸振动产生。

图3 POC晶体的红外谱图Fig.3 FTIR spectrum of POC crystal

POC晶体的分子式为C120H96N12O4，理论上：C 81.54%，H 5.47%，N 9.50%。通过元素分析后得到：C 81.36%，H 5.32%，N 9.45%。

以上所有表征均与文献［24］报道相符，证明成功合成POC。

2.1.4热稳定性及比表面积分析在毛细管电色谱中，固定相材料的稳定性对实验结果有很大影响。CEC在运行过程中，毛细管色谱柱两端施加的电压高达上万伏，由于管壁内径极小，很容易产生大量焦耳热，所以用于毛细管电色谱的固定相需要具有较好的热稳定性。本文通过热重实验进行了POC的热稳定性分析。从25℃匀速升温到800℃，发现在约300℃时材料开始大量分解，表明POC热稳定性较好。

POC是一种具有空腔结构的多孔材料，为测试其比表面积、空腔结构的体积及孔径大小，对其进行氮气吸附实验。结果显示，POC的比表面积为408.64 m2·g－1，孔体积为0.15 cm3·g－1，孔径大小为1.67 nm。

2.1.5扫描电镜表征将POC溶于二氯甲烷，用高纯氮气推入毛细管内制成开管柱。将制成的色谱柱进行扫描电镜（SEM）分析，观察该多孔材料在毛细管内壁的涂敷情况，结果见图4。可以看到，涂层厚度约为1μm，且POC均匀涂敷在毛细管内壁上。

图4 空管柱（A）和POC手性色谱柱（B）的扫描电镜图Fig.4 SEM images of empty tube column（A）and POC chiral chromatographic column（B）

2.2 电压选择及pH值对POC手性色谱柱电渗流的影响

本实验在Tris－H3PO4缓冲溶液浓度为100 mmol/L，pH值为3.51的条件下，将工作电压从6 kV逐渐增加到18 kV，测试了色谱柱工作电压与电流的关系。发现随着电压的增加，工作电流线性增加（r=0.992）。当电压在6～18 kV范围时，产生的焦耳热较小，可用作分离电压。

选择Tris－H3PO4缓冲溶液浓度为100 mmol/L，以硫脲作标记物，分离电压为15 kV，分别对空管柱、POC开管毛细管柱在不同pH值流动相中的电渗流变化情况进行考察，结果见图5。随着pH值增加，空管柱和POC色谱柱的电渗流均增加，但POC色谱柱电渗流的增加趋势较缓慢，且在相同情况下，其电渗流大小均小于空管柱。这是因为，与空管柱相比，POC色谱柱上涂敷有一层多孔材料，与缓冲溶液的接触面积远低于空管柱，毛细管内壁解离出的Si－O－数量较少，电渗流较小。

图5 POC手性柱电渗流随pH值的变化情况Fig.5 Changes of electroosmotic flow of POC chiral column with pH values

2.3 POC手性色谱柱对位置异构体的拆分

硝基苯酚与硝基苯胺均有3个位置异构体，因结构存在差异，用途也各不相同。为检测POC手性毛细管柱对位置异构体的拆分性能，尝试使用该色谱柱对o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-硝基苯胺进行拆分。本实验选择浓度为100 mmol/L、pH 3.51的Tris－H3PO4缓冲溶液进行分离测试（分离电压为15 kV），结果见表1。图6为上述3种位置异构体的分离谱图。可以看到，POC毛细管色谱柱对o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-硝基苯胺的分离效果较好。这是因为，POC是一种手性多孔材料，具有多个手性识别位点，当位置异构体通过该手性色谱柱时，与多孔材料充分接触并发生相互作用，且位置异构体的分子结构、大小存在差异，从而可达到分离。

图6 POC毛细管柱对o，m，p-硝基苯酚（A）和o，m，p-硝基苯胺（B）位置异构体的拆分色谱图Fig.6 Chromatograms of o，m，p-nitropheno（lA）and o，m，p-nitropheniline（B）positional isomers on POC column chromatographic column：58 cm×75μm（effective length 52 cm），pH 3.51，100 mmol/L Tris－H3PO4 system，separation voltage：15 kV，injection time：5 s

表1 位置异构体在POC手性柱上的分离情况Table 1 Separation of positional isomers on POC chiral column

2.4 POC手性毛细管柱对手性化合物的拆分

为探究POC毛细管柱对手性化合物的拆分能力，选用二氢黄酮与酮洛芬进行测试。通过改变电压、缓冲溶液的浓度和pH值，探讨两者在POC毛细管柱中获得最佳分离效果的实验条件。

2.4.1分离电压对手性化合物拆分的影响选用100 mmol/L，pH 3.51的Tris－H3PO4缓冲体系，考察分离电压对手性化合物二氢黄酮与酮洛芬拆分的影响，结果见表2和图7。当电压从15 kV增加至16 kV时，二氢黄酮的分离度由0.34增大到1.52，而电压上升至17 kV时，分离度反而降低。酮洛芬在13 kV下的分离度为3.58，且峰拖尾较严重；电压为14 kV时，可获得最大分离度。随着分离电压增大，分析样品的出峰时间缩短。但当工作电压超过一定范围时，会在柱内产生大量的焦耳热，影响拆分手性化合物的效率。

图7 POC毛细管柱在不同分离电压下对二氢黄酮（A）与酮洛芬（B）手性样品的拆分谱图Fig.7 Chromatograms of flavonone（A）and ketoprofen（B）chiral samples by POC column under different separation voltages chromatographic column 58 cm×75μm（effective length 52 cm），pH 3.51，100 mmol/L Tris－H3PO4 system，separation voltage：15 kV，injection time：5 s

表2 不同分离电压对外消旋体的拆分情况Table 2 Separation of racemates by different separation voltages

2.4.2缓冲溶液浓度对手性化合物拆分的影响在最佳分离电压下，考察了pH 3.51的不同浓度的缓冲溶液对手性化合物二氢黄酮和酮洛芬在POC手性毛细管柱上拆分的影响。发现当缓冲溶液浓度由75 mmol/L增到100 mmol/L时，两者的分离度均增加；当浓度上升至125 mmol/L时，其分离度均不同程度的降低。即在POC手性毛细管柱中，二氢黄酮与酮洛芬获得最佳分离度所需的缓冲溶液的浓度为100 mmol/L。由此可知缓冲溶液的浓度对手性样品分离度的影响较大，在一定范围内，分离度随着浓度的增大而增大，可能是因为随着缓冲溶液浓度的增加，毛细管柱内的电渗流降低，致使手性化合物表观淌度增加；但当缓冲液浓度超过该范围时，由于柱内焦耳热过大，引起区带展宽，使得分离度降低，甚至无法拆分对映异构体。

2.4.3缓冲溶液pH值对手性化合物拆分的影响缓冲溶液pH值的改变会引起溶质数量及溶质所带电荷性质的改变，进而导致毛细管内电渗流的改变。在一定范围内，随着缓冲溶液pH值的增加，手性样品的分离时间缩短，分离效率提高。同时缓冲溶液pH值的稳定性对CEC中的电渗流存在一定影响，进而影响分析结果的稳定性与重现性［25］。故在分离手性药品时，必须在pH值适宜的缓冲溶液中进行。

在获得的二氢黄酮和酮洛芬的最佳分离电压和缓冲溶液浓度条件下，通过改变缓冲溶液的pH值，考察其对手性样品拆分的影响，结果见表3。

表3 不同pH值的缓冲溶液对外消旋体的拆分情况Table 3 The resolution of racemates in buffer solutions with different pH values

由表3可知，在分离电压为16 kV，缓冲溶液浓度为100 mmol/L，pH 4.5时，二氢黄酮获得最大分离度；当pH值从2.5增至3.5时，酮洛芬的分离度为5.57，pH 4.5时，分离度下降为4.26。说明缓冲溶液的pH值应控制在一定范围内，否则会影响拆分效果。根据上述实验结果，获得二氢黄酮和酮洛芬在POC毛细管柱上的最佳分离条件（见表4），其分离色谱图见图8。该手性色谱柱可以拆分二氢黄酮与酮洛芬，可能是由于手性样品与有机分子笼之间存在立体构型匹配作用、主－客体包含作用和π－π相互作用。由于微观结构对识别手性化合物的影响是一个十分复杂的问题，目前还无法准确阐述其拆分手性化合物的机理。

表4 外消旋体在POC毛细管柱上获最大分离度的实验条件Table 4 Experimental conditions for maximum resolution of racemate on POC column

图8 POC毛细管柱分离二氢黄酮（A）与酮洛芬（B）手性化合物的色谱图Fig.8 Chromatograms of the separation of flavonone（A）and ketoprofen（B）chiral compounds on POC column

2.5 POC手性毛细管柱重现性及稳定性评价

选择酮洛芬为测试物，在工作电压16 kV、pH 3.5的100 mmol/L的缓冲溶液中进行实验，考察了POC手性毛细管柱的稳定性及重现性。连续5次进样，酮洛芬保留时间的相对标准偏差（RSD）为1.2%；连续3 d进样，其保留时间的RSD为4.0%。在同等条件下制备3根手性柱对酮洛芬进行拆分，其保留时间的RSD为5.5%。结果表明，POC手性毛细管柱具有较好的稳定性和重现性。

3 结 论

本文以（1R，2R）-二苯乙二胺与2-羟基-1，3，5-均苯三甲醛合成了羟基官能团化的多孔有机笼，并将其制成开管色谱柱。成功拆分了o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-硝基苯胺两个位置异构体。并通过改变工作电压、缓冲溶液的浓度及pH值获得了二氢黄酮和酮洛芬在POC手性毛细管柱上的最佳分离条件。POC毛细管柱拆分手性化合物具有一定的可行性，重现性与稳定性较好，可以作为毛细管电色谱固定相。