超高效液相色谱－串联质谱法测定蜂蜜中胆碱和乙酰胆碱

薛 霞，丁 一，公丕学，卢兰香，王 骏，张艳侠，武传香，宿书芳，魏莉莉，刘艳明，胡 梅

（山东省食品药品检验研究院 山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心 山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，山东 济南 250101）

蜂蜜所含的单糖无需消化即可被人体吸收，对妇、幼特别是老人具有良好的保健作用，因而被称为“老人的牛奶”［1－2］。近年来，受蜂蜜产量、价格及检测标准滞后等因素的影响，不少商贩采用各种掺假手段生产低质量蜂蜜，甚至假蜂蜜，以赚取高额利润。掺假蜂蜜极大损害了蜂农、消费者和正规蜂蜜生产企业的利益，严重影响了蜂蜜的市场秩序和出口贸易。为提高蜂农的生产积极性，维护蜂蜜市场秩序，促进我国蜂蜜产业的健康发展，建立一套灵敏、高效、准确的蜂蜜内源性成分的分析方法，对蜂蜜掺伪鉴别具有重要意义与价值。

乙酰胆碱是重要的神经递质，参与调节多种神经功能。胆碱是卵磷脂和鞘磷脂的组成部分，同时又是乙酰胆碱的前体［3－4］。蜂蜜中的乙酰胆碱无需经过体内合成即可直接被人体神经细胞吸收和利用；蜂蜜中大量的胆碱在人体内发生生化反应，还可合成具有生理活性的乙酰胆碱。因此，经常服用蜂蜜可以提高脑内乙酰胆碱的含量，从而促进、激活脑神经传导功能，提高信息传递速度，增强大脑记忆能力。此外，蜂蜜中的乙酰胆碱进入人体后，还可对副交感神经发生作用，促进胃肠蠕动。

关于胆碱和乙酰胆碱含量的测定，报道较多的方法有比色法［5－6］、毛细管电泳法［7］、离子色谱法［8－9］、液相色谱法［10－13］、液相色谱－质谱联用法［14－20］等。传统的比色法操作繁琐、分析时间长，而且前处理易造成样品损失，选择性差，干扰因素多。毛细管电泳法的重现性较差。离子色谱法普及性不高、通用性较差；液相色谱法采用的紫外检测器、电导检测器或蒸发光散射检测器均为通用型检测器，灵敏度不高。液相色谱－质谱法具有分离效率高、灵敏度高、特异性强等优点，已成为复杂基质样本中痕量或微量目标物的重要检测手段。乙酰胆碱的测定文献大多集中在血浆、鼠脑等生物样本［6，12，18－19］，而胆碱的现有文献多为婴幼儿配方乳粉、乳粉和特殊医学配方食品的研究［5，15－17，20］。目前尚未见蜂蜜中胆碱与乙酰胆碱同时测定的文献报道。

本文建立了超高效液相色谱－串联质谱同时测定蜂蜜中胆碱和乙酰胆碱含量的分析方法，方法操作简单、专属性好、准确性高，已成功应用于实际蜂蜜样品中胆碱和乙酰胆碱的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AB SCIEX Triple Quad 5500三重四极杆质谱分析仪（配有电喷雾电离源ESI，美国SCIEX公司）；3－18K台式高速离心机（德国Sigma公司）；BT 125D电子天平（德国Sartorius公司）；MS3型旋涡混合器（德国IKA公司）；SB－800DTD超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Milli－Q超纯水系统（美国Millipore公司）；BEH HILIC色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm，美国Waters公司）。

氯化胆碱（CAS号：67－48－1，纯度97.0%）、氯化乙酰胆碱（CAS号：60－31－1，纯度99.7%）标准品，购于上海甄准生物科技有限公司；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；乙酸铵、乙酸（色谱纯，美国Fluka公司）；高氯酸（分析纯，天津政成化学制品有限公司）；盐酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 样品采集

天然成熟蜂蜜均购自当地蜂农，并于4℃冰箱中保存。其它蜂蜜和糖浆购自网购平台。

1.3 样品处理

准确称取1 g（精确至0.01 g）试样于25 mL比色管中，加入10 mL水涡旋混匀，超声15 min，取出恢复至室温后用乙腈定容至刻度，摇匀。准确移取1.0 mL提取溶液于50 mL容量瓶中，用乙腈－水（体积比8∶2）稀释并定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤，上机测定。

1.4 色谱－质谱条件

1.4.1色谱条件色谱柱：BEH HILIC（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流动相：A相为10 mmol/L乙酸铵（含0.1%乙酸）溶液，B相为乙腈；柱温：40℃；进样量：2μL，流速：0.35 mL/min。梯度洗脱程序：0～3.5 min（90%～60%B），3.5～4.5 min（60%～40%B），4.5～5.5 min（40%B），5.5～5.6 min（40%～90%B），5.6～8.0 min（90%B）。

1.4.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI源）；检测方式：多反应监测（MRM）；扫描方式：正离子模式扫描；电喷雾电压：5 500 V；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：40 psi；辅助气压力：50 psi；碰撞气压力：8 psi；离子源温度：550℃。母离子、子离子、去簇电压、驻留时间及碰撞能量见表1。

表1 乙酰胆碱和胆碱的质谱参数Table 1 MS/MS parameters of acetylcholine and choline

1.5 基质效应评价

分别测定纯溶剂与样品提取液中目标物的峰面积响应值，以二者的相对比值来评价基质效应（Matrix effect）。Matrix effect factor（ME，%）=（A－B）/A×100，其中ME为基质效应因子，A为纯溶剂中目标物的峰面积响应值，B为样品提取液中目标物的峰面积响应值。ME绝对值越大基质效应越强。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

胆碱和乙酰胆碱极性较强，在反相色谱柱上保留弱，峰形拖尾严重。采用HSS T3和Xbridge C18两种常用于极性化合物的反相色谱柱进行分析时发现：即使流动相中有机相的比例降为5%，胆碱和乙酰胆碱在两种反相柱上的保留时间仍不足1 min；文献［11］采用添加离子对试剂的方法增强胆碱和乙酰胆碱在反相色谱柱上的保留，但离子对试剂与质谱兼容性差，易对质谱造成污染。亲水作用色谱（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）能为强极性和强亲水性的化合物提供合适的保留，流动相中高比例有机相的使用也有利于提高质谱的离子化效率［21］。本文采用Waters公司ACQUITY UPLCTMBEH HILIC色谱柱进行分离。

在HILIC流动相中，常通过加入缓冲盐改善化合物的峰形。比较了流动相中不含乙酸铵及含5 mmol/L和10 mmol/L乙酸铵时对目标物分析的影响。结果表明：未加入乙酸铵时，色谱峰分叉；随着乙酸铵浓度的增加，峰形逐渐变好，但乙酸铵为10 mmol/L时色谱峰前伸依然明显。在10 mmol/L乙酸铵溶液中加入0.1%（体积分数）乙酸后，胆碱和乙酰胆碱的色谱峰峰形对称，且响应值明显提高。因此，最终采用10 mmol/L乙酸铵（含0.1%乙酸）和乙腈作为流动相。

2.2 质谱条件的优化

胆碱和乙酰胆碱的结构中均含有季铵基团，易被电离成正离子。将标准溶液注入超高效液相色谱－串联质谱仪，在全扫描模式下，获得化合物的分子离子峰，结合化合物分子式，选择分子离子峰均为［M+H］+；在产物离子扫描模式下，以各化合物的分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，获得碎片离子，选择两对丰度较强，基质干扰较小的离子为子离子。在MRM模式下，对去簇电压、碰撞能等质谱参数进行优化，优化后的质谱条件见表1。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1水解必要性考察胆碱是强有机碱性化合物，以游离态胆碱、乙酰胆碱、卵磷脂、鞘磷脂等形式广泛存在于生物机体中。测定婴幼儿配方乳粉、乳粉等基质中胆碱时通常采用恒温水解的方式释放结合态，测定总胆碱含量［5，15，20，22］。结合文献，本研究考察了盐酸水解方法对蜂蜜中胆碱和乙酰胆碱提取效率的影响。以同一个天然成熟的洋槐蜜样本进行考察。A组样品按照“1.3”进行处理，B组样品的制备步骤为：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，加入10 mL 1.0 mol/L HCl涡旋混合均匀后，在70℃下水浴水解3 h，水解后冷却至室温，转移至25 mL比色管或容量瓶中，用水定容至刻度。最后用乙腈－水（体积比8∶2）稀释50倍，过膜上机测定。每组样品均平行测定3次。结果发现，A组乙酰胆碱的含量分别为3.86、3.75、3.68 mg/kg；胆碱的含量分别为27.50、28.62、28.49 mg/kg。B组乙酰胆碱的含量分别为0.26、0.31、0.24 mg/kg；胆碱的含量分别为28.75、29.56、29.04 mg/kg。由此可见水解过程中乙酰胆碱损失严重，胆碱含量变化不明显。原因可能是蜂蜜中的胆碱主要以游离态存在，结合态含量很低，且其在酸性条件下热稳定性较好，因此水解前后含量变化不大。乙酰胆碱是胆碱和乙酸形成的酯，其最稳定的pH值为3.8～4.5［23］，在加热、强酸性条件下可能发生水解反应，故损失明显。而实验所用蜂蜜样品中乙酰胆碱含量约为胆碱含量的十分之一，即便乙酰胆碱水解产生了部分胆碱，胆碱含量的增加也不显著。因此，本研究未进行水解反应直接进行测定。

2.3.2提取溶剂的选择胆碱和乙酰胆碱均易溶于水，蜂蜜中糖含量较高，样本粘稠，水系溶剂能使样品均匀分散，更有利于目标物的提取。生物样本中胆碱和乙酰胆碱的测定常采用高氯酸［10］或乙腈［18］进行蛋白沉淀。本实验分别考察了0.4 mol/L高氯酸溶液、水－乙腈溶液（体积比2∶3）、0.1%甲酸水－乙腈（体积比2∶3）溶液和纯水4种提取溶剂对提取效率的影响。向空白果葡糖浆（F55）基质中加入1.0 mg/kg和10.0 mg/kg的乙酰胆碱和胆碱标准品，分别用上述提取溶剂进行提取，基质匹配标准工作曲线进行定量，计算回收率。结果显示，用0.4 mol/L高氯酸溶液提取后胆碱的回收率为137%，纯水提取后其回收率不足85%，用0.1%甲酸水－乙腈（体积比2∶3）溶液提取后，胆碱的基质效应明显（23.1%）。综合以上因素，最终选择水－乙腈（体积比2∶3）溶液作为提取溶剂，此时胆碱和乙酰胆碱的回收率分别为102%和91.8%。

2.3.3净化条件的考察为减少蜂蜜中大量的糖类物质对仪器的污染，需对样本进行净化。陈舒舒等［24］的研究表明，N-丙基乙二胺固相吸附剂（PSA）可有效吸附蜂蜜中的糖类及有机色素等杂质。本文考察了PSA对蜂蜜中胆碱和乙酰胆碱的净化效果。蜂蜜用水溶解后，以乙腈定容至刻度，混合均匀，加入固体氯化钠使乙腈与水分层。移取1 mL乙腈层，加入150 mg无水硫酸镁，再加入25 mg PSA涡旋混合、离心后过滤，上机测定。结果发现：乙酰胆碱的回收率仅为17.5%，胆碱的回收率为零。这是因为胆碱和乙酰胆碱在水中溶解性好，无法萃取到乙腈层中。

为降低糖分对仪器的污染，采用乙腈－水（体积比8∶2）对糖浆和蜂蜜的提取溶液进行稀释。发现稀释倍数为50时，回收率及基质效应均满足定量要求。

2.4 基质效应评价

进一步对洋槐蜜和果葡糖浆（F55）中2个目标物的基质效应进行考察，结果显示：水－乙腈（2∶3）作为提取溶剂时，样品中胆碱和乙酰胆碱的ME均小于10%，基质效应不明显，满足定量需求。由于蜂蜜中大都含有胆碱和乙酰胆碱，很难得到空白基质。本方法采用纯溶剂标准曲线定量，减少了匹配相同空白基质的难操作性和不同空白样品匹配的差异性。

2.5 方法学验证

2.5.1线性关系、检出限及定量下限将质量浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、2.5、5 ng/mL和0.5、1、5、10、25、50 ng/mL的乙酰胆碱和胆碱混合标准工作溶液按“1.4”条件进行测定，以质量浓度（X）为横坐标，各化合物的定量离子峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，在0.05～5 ng/mL和0.5～50 ng/mL范围内，乙酰胆碱和胆碱线性关系良好，线性方程分别为：Y=2.223 04×106X+2 978.314 58和Y=5.776 37×105X+1.777 38×105，相关系数均（r2）大于0.99。以峰高3倍信噪比处对应的浓度作为方法检出限（LOD）；以峰高10倍信噪比处对应的浓度作为方法定量下限（LOQ）。乙酰胆碱的LOD和LOQ分别为0.05、0.1 mg/kg；胆碱的LOD和LOQ分别为0.5、1.0 mg/kg。果葡糖浆（F55）LOQ水平的加标谱图见图1。

图1 果葡糖浆（F55）中乙酰胆碱（A）和胆碱（B）定量下限加标水平的色谱图Fig.1 MRM chromatograms of showing the LOQs for acetylcholine（A）and choline（B）spiked in high fructose syrup（F55）

2.5.2回收率与相对标准偏差在果葡糖浆（F55）样品中添加一定量的乙酰胆碱和胆碱混合标准溶液，两者的浓度水平分别为0.1、1、5 mg/kg和1、10、50 mg/kg；洋槐蜂蜜中乙酰胆碱和胆碱的加标浓度水平分别为5、50 mg/kg，平行测定6次，计算方法回收率和相对标准偏差（RSD）。结果见表2。乙酰胆碱和胆碱在糖浆和洋槐蜂蜜中的回收率为97.3%～103%，RSD均不大于5.1%，结果满足GB/T 27404－2008［25］对回收率和精密度的要求。

表2 乙酰胆碱和胆碱的回收率和相对标准偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of acetylcholine and choline（n=6）

2.6 实际样品应用

利用本方法对天然成熟的真蜂蜜38批次（洋槐蜂蜜19批次、枣花蜂蜜10批次、荆条蜂蜜9批次），网购的廉价蜂蜜32批次（洋槐蜂蜜12批次、枣花蜂蜜10批次、荆条蜂蜜10批次），果葡糖浆（F55）、果葡糖浆（F42）、甜菜糖浆、大米糖浆等10批次糖浆类样品进行检测。结果表明，糖浆中乙酰胆碱和胆碱均未检出，其余不同种类的天然成熟蜂蜜、网购廉价蜂蜜的检测结果见表3。洋槐蜜的色谱图见图2。

图2 洋槐蜜样品中乙酰胆碱（A）和胆碱（B）的色谱图Fig.2 MRM chromatograms of acetylcholine（A）and choline（B）in an acacia honey sample

表3 蜂蜜中乙酰胆碱和胆碱的含量（n=3）Table 3 Determination of acetylcholine and choline in honey（n=3）

由表3可知，天然成熟洋槐蜜中胆碱含量明显高于枣花蜜和荆条蜜，乙酰胆碱含量也高于枣花蜜，与荆条蜜相当。迄今为止，已经证实在30多科50多种高等植物体内存在乙酰胆碱［23］，而乙酰胆碱是胆碱与乙酸形成的酯，因此不同蜂蜜中胆碱与乙酰胆碱的含量差异可能与花的种类及花期有较大联系。天然成熟蜜中的乙酰胆碱和胆碱含量明显高于廉价蜂蜜，原因可能与蜂蜜中掺入糖浆有关。

3 结 论

本文建立了超高效液相色谱－串联质谱同时测定蜂蜜中胆碱和乙酰胆碱的快速分析方法。样品用水－乙腈（2∶3）提取，适当稀释后进行测定，方法操作简单、专属性好、准确性高。胆碱和乙酰胆碱作为内源性物质，其含量水平可为天然成熟蜂蜜、廉价蜂蜜和糖浆的区分提供帮助。该方法对规范蜂产品市场、保障消费者合法权益以及促进我国蜂产品事业的健康发展具有重要意义。