超高效液相色谱－串联质谱法测定土壤中18种全氟和多氟烷基化合物

钱佳浩，朱清禾，万 江，王佳希，张 卫，杨 洁*

（1.华东理工大学，国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海 200237；2.上海市环境科学研究院，国家环境保护城市土壤污染控制与修复工程技术中心，上海 200233）

全氟及多氟烷基化合物（PFASs）是分子碳链上的氢原子完全或部分被氟原子取代的一类有机化合物［1］。PFASs因具有优异的疏水疏油性以及低表面张力［2］，广泛应用于生产生活，例如地毯、润滑剂、消防泡沫以及食品包装纸等［2］。目前，PFASs在土壤［3］、大气［4］、水体［5］、沉积物［6］、灰尘［7］、动物［8］和人类血清［9］等环境介质和生物体中均有检出。PFASs的碳氟键能高，具有极强的化学稳定性和热稳定性［10］，导致其一旦进入环境就很难自然降解。PFASs可通过灰尘、饮用水以及动植物的食物链等多种途径进入人体，毒理学研究发现其对内分泌、神经、免疫、生殖等系统均具有毒性和致癌性，危害人体健康［1］。近年来，PFASs受到广泛关注，特别是环境介质（水、土壤、沉积物）中的PFASs。

我国针对环境介质中PFASs的提取及检测方法尚未制定相关标准，目前的研究主要集中于水体［11］，土壤中PFASs分析方法的研究相对较少。谢琳娜等［12］采用固相萃取结合高效液相色谱－质谱法分析土壤中C4～C14全氟羧酸以及C4～C7全氟磺酸的含量，经甲醇超声提取、柱纯化等步骤，15种PFASs化合物的回收率为75.8%～113.0%。陈勇杰等［13］建立了污泥基质中PFASs前驱体的检测方法，包括氟调醇类化合物和全氟辛烷磺酰胺类化合物。随着近年来分析技术的飞速发展，能检测出的PFASs种类不断扩充。例如，应用于医药中间体的全氟十六烷酸及全氟十八烷酸，这些长链PFASs可能比中短链PFASs具有更强的生物累积性和毒性［14］，且更易吸附在土壤介质中［15－16］；全氟（2-甲基-3-氧杂己酸）（GenX）作为全氟辛酸（PFOA）的替代物，2019年被欧盟列为极高关注污染物，这些新兴污染物也将成为土壤中PFASs的重要组成与监测对象。另外不同于水体介质，土壤粒径、有机质等因素会影响PFASs的吸附、解吸能力［16］，因此土壤中PFASs的提取方法亟需进一步优化。

本研究采用固相萃取/超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS/MS）技术，对包括C3～C18的全氟羧酸、C4～C8的全氟磺酸以及全氟醚羧酸GenX进行了检测，并对土壤粒径、超声温度、超声时间、固相萃取柱种类以及洗脱液浓度进行了优化。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

三重四极杆液相色谱－质谱联用仪（日本岛津公司），DTC－33静音型超声波清洗机（湖北鼎泰高科有限公司），VM－D涡旋混合器（上海舍岩仪器有限公司），Sorvall™LYNX高速离心机（德国赛默飞世尔科技公司），Supelco固相萃取仪、Milli－Q超纯水仪（美国默克公司）。

18种污染物的具体信息见表1。全氟癸酸、全氟十一酸、全氟己烷磺酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，全氟壬酸、全氟十二酸、全氟丁烷磺酸购于上海泰坦科技股份有限公司，全氟十三酸、全氟十四酸、全氟十六酸、全氟十八酸及提取内标（MPFAC－C－ES）购于加拿大Wellington Laboratories，其它标准品购于上海安谱实验科技有限公司，纯度均大于98%。甲醇（色谱纯）、氨水（分析纯）、乙酸钠（分析纯）等试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 样品采集与处理

分别称取适量的18种PFASs标准品，以甲醇溶解并定容，配制成200 mg/L的PFASs混合标准溶液，将上述溶液稀释成500μg/L作为PFASs储备液，备用。采集上海某地土壤作为空白样品，取10 mL的PFASs储备液，少量多次加入50 g空白土壤中并充分搅拌均匀，通风橱中待溶剂挥发后得100 ng/g污染土壤。

准确称取1.0 g 60目的土壤样品（精确至0.001 g）置于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 ng提取内标和5 mL甲醇，涡旋1 min使其均质化，静置5 min后，40℃超声10 min，然后以3 600 r/min离心10 min，将上清液收集至另一离心管中。以上提取过程重复2次，合并上清液约15 mL，在温和的高纯度氮气下浓缩上清液至1～2 mL，浓缩后的提取液用超纯水稀释至50 mL。将上述稀释后的样品加入WAX Oasis固相萃取柱中进行纯化（加入样品前分别用4 mL甲醇、4 mL 0.1%氨水－甲醇溶液和10 mL超纯水活化萃取柱），弃去流出液，之后用10 mL超纯水和8 mL 25 mmol/L乙酸钠溶液淋洗固相萃取柱以去除杂质，最后用2 mL甲醇和4 mL 0.1%氨水－甲醇溶液洗脱并收集PFASs，高纯度氮气流下吹至近干，重新定容于1 mL甲醇，涡旋30 s，过0.22μm滤膜后待测。每组实验条件设置2个平行组。

实际土样测定中，S1和S2样品取自上海浦东某工业园区，S3样品取自上海浦东某电镀厂周边，均取0～15 cm表层土壤，每个采样点取5份土样（5 m×5 m）混合而成，代表功能区周边PFASs的平均含量。

1.3 测定条件

色谱条件：采用三重四极杆液相色谱－质谱联用仪对PFASs进行分析，ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm），柱温为40℃。流动相：A相为5 mmol/L乙酸铵溶液，B相为甲醇；洗脱程序为：0～1 min，25%B；1～3.5 min，25%～75%B；3.5～8 min，75%B；8～10 min，75%～95%B；10～12 min；95%B；12～12.5 min，95%～25%B。进 样 体 积 为5μL，流 速 为0.4 mL/min。

质谱条件：电喷雾电离（ESI）负离子模式，采集方式为多反应监测（MRM）模式，离子喷雾电压为-4 500 V，雾化气流速为3 L/min，加热气流速为15 L/min，干燥气流速为5 L/min，接口温度为300℃，DL温度为100℃，加热块温度为200℃。18种PFASs及13种内标的质谱MRM参数见表2。

表2 18种PFASs及13种提取内标的质谱多反应监测参数Table 2 MRM parameters of mass spectrometry for 18 PFASs and 13 internal extraction standards

1.4 质量控制与保证

在样品前处理过程中避免接触和使用聚四氟乙烯或其他含氟聚合物材料，所有容器用去离子水和甲醇进行预处理，以减小背景污染。每提取12个样品做1个实验空白样品，测定供试容器、试剂中可能带入的PFASs。上机测试时，每隔6个样品运行1次空白针，以检测实验过程可能造成的污染以及样品在仪器中的残留，实验空白样品和空白针中目标化合物的含量均须低于仪器检出限。

1.5 数据处理分析

采用Excel 2010与Origin 2016软件进行数据的统计分析及作图。

2 结果与讨论

2.1 土壤粒径的优化

对比了不同土壤粒径对18种PFASs提取回收率的影响。由图1可知，20目、60目和100目土壤中，18种PFASs的提取回收率分别为58.5%～137%、78.5%～138%、76.6%～135%，其中粒径为20目的土壤中PFASs的提取回收率最低，尤其是PFPrA、PFTeDA、PFHxDA及PFOcDA，回收率不足70.0%，远低于60目及100目土壤。这是由于随着土壤粒径减小，其比表面积增大，提取液更易进入土壤样品的颗粒孔隙中与PFASs充分接触。因此，粒径小的土壤样品中PFASs的提取回收率更好，尤其是长链PFASs，可能由于长链PFASs比短链在土壤中的吸附作用强［16］，更需要与提取液充分接触。60目与100目的土壤样品中PFASs的提取回收率相当，说明前者能充分满足PFASs的提取需求，因此选择土壤粒径为60目。

图1 土壤粒径对PFASs回收率的影响Fig.1 Influence of soil particle size on the recoveries of PFASs

2.2 超声温度的优化

考察了超声温度（30、40、50℃）对18种PFASs提取回收率的影响，结果显示PFOA、PFNA、PFDA等大部分PFASs受超声温度的影响较小，在上述3个温度下目标物的回收率相当。然而对于PFPrA、PFHxDA及PFOcDA，以40℃下的提取回收率较优，30℃下的提取回收率最低（PFHxDA及PFOcDA的提取回收率不足40.0%），50℃下长链PFASs的提取回收率不及40℃，故采用最佳超声温度为40℃。

2.3 超声时间的优化

考察了超声时间（10、20 min）对18种PFASs提取回收率的影响，结果表明超声时间对PFASs提取回收率的影响较小，上述2种超声时间下PFASs的提取回收率相当，与文献［12，17］的研究结果一致。为节省时间，选择最佳超声时间为10 min。

2.4 固相萃取柱的优化

WAX Oasis与ENVI-carb是PFASs提取中常用的固相萃取柱，两者分别为弱阴离子交换柱以及活性炭固相萃取柱。比较了上述2种不同类型萃取柱对18种PFASs提取回收率的影响，并对比了不同填料规格（150 mg/6 mL、500 mg/6 mL）的WAX Oasis固相萃取柱，结果如图2所示。

由图2可知，WAX Oasis固相萃取柱对PFASs的提取回收率高于ENVI-carb固相萃取柱（100 mg/1 mL）。WAX Oasis与ENVI-carb两种萃取柱对GenX、PFHpA、PFHxS、PFOA、PFNA、PFOS及PFDA的回收率相当（77.8%～137%）；PFPrA、PFBA、PFPeA 3种短链PFASs以及PFDoDA、PFTrDA、PFTeDA、PFHxDA、PFOcDA 5种长链PFASs在WAX Oasis柱中的回收率分别为75.0%～128%（150 mg/6 mL）和63.0%～128%（500 mg/6 mL），但ENVI-carb固相萃取柱对以上目标物的回收率不足35.0%，甚至几乎为0（如PFPrA、PFHxDA等），这与文献［13，18］的研究报道一致。由于ENVI-carb萃取柱与目标物仅存在非极性相互作用力，短链PFASs的极性强、疏水作用较弱，可能不易结合于萃取柱中而降低回收率，而长链化合物的疏水性强，吸附在萃取柱上的PFASs可能不易被洗脱而导致回收率低。WAX Oasis固相萃取柱的填料中含有哌嗪环［13］，主要通过离子交换作用吸附PFASs，目标物的提取效率与其疏水性相关性较小，故大部分目标物在WAX Oasis柱的回收率较好，因此ENVI-carb柱不适用于短链（C＜5）及长链（C＞12）PFASs，WAX Oasis柱对PFASs的适用范围更广。对比不同规格的萃取柱发现，WAX Oasis（150 mg/6 mL）对各PFASs的回收率与WAX Oasis（500 mg/6 mL）无明显差异，尽管供试样品中PFASs的总质量浓度达1 800μg/L，远高于实际土壤中PFASs的含量，但WAX Oasis（150 mg/6 mL）仍可实现高效回收，因此采用WAX Oasis（150 mg/6 mL）固相萃取柱能够满足土壤中PFASs类化合物的提取需求。

图2 固相萃取柱对PFASs回收率的影响Fig.2 Influence of solid phase extraction column on the recoveries of PFASs

2.5 洗脱液浓度的优化

当PFASs化合物结合于固相萃取柱后，洗脱液极性是影响回收率的另一重要因素。实验采用甲醇与氨水－甲醇溶液联用洗脱固相萃取柱中的目标物，比较了不同氨水－甲醇浓度（0.1%、0.5%、1%）对PFASs提取回收率的影响（图3）。结果发现，0.1%氨水－甲醇溶液对各PFASs的洗脱效率优于其它2种洗脱液，可能由于高浓度氨水－甲醇溶液会引入较多的水，造成洗脱液极性增强，洗脱能力下降［13］。因此，选择最佳洗脱液为甲醇和0.1%氨水－甲醇溶液。

图3 洗脱液浓度对PFASs回收率的影响Fig.3 Influence of eluent concentration on the recoveries of PFASs

2.6 方法的分析性能

分别配制0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、200μg/L的PFASs系列混合标准溶液，以目标物标准溶液的质量浓度为横坐标（x，μg/L），对应峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。结果显示，18种PFASs在0.05～200μg/L质量浓度范围内线性良好，相关系数（r2）均大于0.996。以3倍信噪比计算仪器检出限（LOD），以10倍信噪比计算方法定量下限（LOQ），方法检出限为0.003～0.100μg/L，定量下限为0.010～0.300μg/L，与文献报道方法［17-18］相当甚至更低（见表3）。优化条件下18种PFASs混标（50μg/L）的色谱图见图4。

图4 18种PFASs混标的色谱图（50μg/L）Fig.4 Chromatogram of 18 PFASs mixed standard solution（50μg/L）

表3 18种PFASs的线性关系、检出限及定量下限Table 3 Linear relations，LODs and LOQs of 18 PFASs

采用空白样品（除PFOA检出0.12 ng/g，其他PFASs均低于检出限）加标方式，考察基质效应对18种PFASs回收率的影响。土壤加标浓度为1、5、100 ng/g，平行配制3份。土壤样品中18种PFASs的回收率为76.3%～132%，相对标准偏差（RSD）为0.40%～11%，能够满足定量分析的基本要求。

（续表3）

2.7 实际样品分析

应用本方法对上海工业区土壤中PFASs含量进行检测（见图5）。结果表明，S1、S2和S3样品中PFASs的总含量分别为12.37、56.00、25.74 ng/g，其PFASs总体含量远高于文献报道的天津、安徽地区土壤［19－20］。18种PFASs均检出，其中PFPrA、PFBS、PFHxA、PFHpA、PFHxS、PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA、PFDoDA、PFTeDA、PFHxDA及PFOcDA在3个土壤样品中普遍存在，说明土壤中污染物种类多样化。PFOA和PFOS是供试土壤样品中PFASs的重要组成部分，占比分别为24%～66%、3%～28%，这与两者在工业生产中使用量较大相关。新型PFASs化合物GenX在S2样品中检出，占比为2.4%，应当引起关注。

图5 实际土壤样品中PFASs的含量及组成Fig.5 Contents and composition of PFASs in actual soil samples PFASs with relative percentages greater than 5%are marked in the figure（图中标记出PFOS及相对百分比大于5%的PFASs组分）

2.8 方法对比

比较本方法和文献报道中的前处理方法对内标回收率的影响，具体前处理方法分别为：①以2 mL 1%氨水-甲醇溶液于40℃超声提取15 min［12］；②以10 mL甲醇于40℃超声提取30 min［21］；③以2 mL乙腈于40℃超声提取30 min［22］；④以5 mL甲醇于40℃超声提取10 min（本方法）。由图6可知，在提取出的PFASs中，本方法与文献报道方法相比，时间更短、回收率更高，满足大批量土壤样品提取的需求。

图6 4种土壤前处理方法的结果比较Fig.6 Comparison results of 4 soil pretreatment methods

3 结 论

本文建立了同时检测包括GenX在内18种PFASs含量的固相萃取/超高效液相色谱－串联质谱方法。该方法操作简单，灵敏度高，具有较高的准确度和精密度，可以快速准确地定量分析土壤中的PFASs含量，为今后土壤中PFASs污染物的采样调查及监测工作提供了技术基础。