sRNA STnc1220基因缺失株对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病力的影响

李 娜，宁程程，郭 蕴，季春辉，王立霞，张亚萍，孟庆玲，乔 军，才学鹏

(1.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.中国兽药监察所，北京 100081)

沙门菌被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)确定为引起重大疾病和死亡的食源性病原体[1]。沙门菌在自然界中分布广泛，可感染人类、家畜和家禽，引起人类肠炎和畜禽、犬、猫及试验动物发生副伤寒；同时还可导致在牛、羊和马流产及急性胃肠炎，具有较强的致病性。对于老人、儿童以及有免疫缺陷的人还会造成生命危险[2]。抗生素的长期使用，导致沙门菌引起的感染日趋严重，对全球公共卫生造成严重威胁[3-4]。因此，深入研究沙门菌侵染和致病的分子机制，对于该病的科学防控及公共卫生安全具有重要的意义。

细菌非编码小RNA(sRNAs)是细菌的一种重要调控分子，通常位于基因间隔区(IGRs)中，在转录后水平调节基因表达方面发挥重要作用[5-6]。细菌sRNAs在不同的环境中广泛表达，可调节包括铁稳态、外膜蛋白的生物合成、群体感应和毒力等多种生命活动过程[7-8]。近年来随着高通量测序技术的不断发展，已在沙门菌 SL1344株的基因组中发现并鉴定了280种sRNAs[9]，然而其大部分sRNAs的生物学特性暂不清楚，Srikumar等[10]研究发现，sRNASTnc1220在沙门菌感染巨噬细胞时该基因表达水平显著下调，推测STnc1220可能与沙门菌侵染及环境应激相关。然而，至今sRNASTnc1220生物学功能尚不清楚。

本研究通过克隆STnc1220基因，分析其分子特征，并利用λ-Red重组技术对sRNASTnc1220进行基因缺失株的构建，比较缺失株与亲本株之间生物学特性的差异，旨在为揭示sRNASTnc1220在沙门菌环境应激和毒力的调控作用及机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒和试剂

鼠伤寒沙门菌SL1344标准毒株、大肠杆菌(E.coli)DH5α、RAW264.7细胞、质粒 pKD46、pKD3、pCP20和PBR322 均由石河子大学预防兽医学实验室保存。试验动物均为6周龄BALB/c小鼠(雌雄各半)，购自新疆医科大学。PCR Mix、DNA Marker，pMD19-T载体和T4DNA连接酶、限制性内切酶均购自大连宝生物公司。

1.2 引物设计

根据GenBank中已经发布的沙门菌 SL1344株基因组序列(登录号：FQ312003.1)，使用DNAStar软件设计引物。P1/P2用于sRNASTnc1220扩增及缺失验证，P3/P4引物用于扩增打靶片段，其5′端含有50 bp部分与sRNASTnc1220基因序列同源，3′端与氯霉素抗性基因cat(来源于质粒pKD3)同源。引物均由北京华大生物公司合成(表 1)。

表1 PCR扩增所需引物Tab.1 Primers required for PCR amplification

1.3 沙门菌 STnc1220基因扩增及分子特征分析

提取SL1344基因组并作为模板，P1/P2为引物PCR扩增出沙门菌非编码sRNASTnc1220。PCR反应体系：PCR Mixture 10 μL，H2O 7 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物各 0.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，16 ℃保存。对目的条带进行胶回收，与pMD19-T载体经16 ℃过夜连接，筛选阳性单菌落并送测序。对测序结果进行启动子序列分析。利用RNAtarget 2在线软件(http：//RNA.informatik.uni-freiburg.de/)进行STnc1220所调控靶基因的预测。

1.4 沙门菌 STnc1220基因缺失株的构建

提取pKD3质粒并作为模板，P3/P4为引物PCR扩增出含有STnc1220基因上、下游同源臂的打靶片段，进行重叠融合PCR(SOE-PCR)扩增。将目的基因进行回收和测序。制备SL1344感受态细胞，电转入pKD46质粒，然后将扩增出的打靶片段电转入SL1344-pKD46 感受态细胞，用含有 Amp 和 Cm 抗性的 LB 平板筛选阳性转化子(ΔSTnc1220∷cat)进行PCR鉴定和测序验证。将pCP20质粒电转化入ΔSTnc1220∷cat感受态细胞中(已消除pKD46质粒)，用含有氨苄抗性的LB平板进行筛选，获得缺失株ΔSTnc1220。

1.5 STnc1220基因缺失对沙门菌生长及生化特性的影响

将3株菌在LB液体培养基连续传代培养至50代，选取第10，20，30，40，50代细菌，用STnc1220基因内部引物P1/P2进行PCR扩增鉴定其是否具备遗传稳定性。参照文献[11]的方法，分别将3株菌接种BHI培养基中，将过夜培养物按1∶100转接新BHI，37 ℃同步振摇培养，通过测定菌液OD600绘制各菌株生长曲线。挑取3株菌的单菌落至木糖、棉子糖、葡萄糖、氰化钾、枸橼酸钠、硫化氢等生化鉴定管，放置37 ℃培养箱培养静置培养18～24 h，按操作说明书观察其生化特性。

1.6 STnc1220基因缺失对沙门菌生物被膜形成的影响

将亲本株和缺失株过夜培养次日转接于新鲜LB培养基中，培养至菌液OD600≈0.2，以每孔200 μL加入96孔微孔板中，37 ℃恒温培养24 h。按照参考文献[12]方法，将菌液吸出后用200 μL去离子水清洗3次，室温晾30 min后每孔加入1%结晶紫100 μL染色45 min，PBS清洗3次；将96孔微孔板置于室温自然晾干，加入95%的乙醇进行脱色，酶标仪测定其OD600。

1.7 STnc1220基因缺失对沙门菌环境应激的影响

挑取亲本株和缺失株的单菌落于BHI培养基中，37 ℃ 180 r/min培养12 h，以1∶100比例分别转接于pH=4.8、pH=9、4% NaCl、2 mmol/L的H2O2、3.8%乙醇的新鲜BHI液体培养基中，调整其初始OD600相同时，置于37 ℃振荡培养箱180 r/min振荡培养，每隔1 h取样测OD600值并绘制生长曲线。

1.8 STnc1220基因缺失对沙门菌细胞黏附和侵袭能力的影响

取生长状态良好的RAW264.7细胞用无菌PBS洗涤3次后用DMEM重悬备用，用预冷无菌 PBS将新鲜培养的亲本株和缺失株洗涤后调整OD600为0.5后置于冰上。参考文献[13]的方法，菌液以感染复数MOI=10侵染细胞，分别进行细胞黏附、侵袭试验，梯度稀释，涂板计数。

1.9 STnc1220基因缺失对沙门菌致病力的影响

将沙门菌 SL1344、ΔSTnc1220培养至对数生长中期，收集菌体并用预冷的无菌PBS洗涤3次，以无菌 PBS重悬菌体并进行连续10倍倍比稀释。分别以1.0×108，1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103cfu/mL的剂量腹腔感染 BALB/c小鼠，注射无菌PBS作为对照组，攻毒之后观察10 d，记录小鼠发病及死亡情况，使用改良寇氏法计算每株菌的半数致死量LD50。分别对6周龄小鼠注射1.0×104cfu/mL的亲本株、缺失株进行腹腔感染。取感染第5 天的小鼠处死后无菌收集它们的肝脏和脾脏，经固定后制作成组织切片进行病理学观察。

2 结果与分析

2.1 沙门菌 sRNA STnc1220基因扩增及分子特征分析

以P1/P2引物扩增出的片段大小为275 bp，测序结果显示，其中sRNASTnc1220基因大小为73 bp，位于基因ssaK和ssaL之间。预测显示在sRNASTnc1220的上游5′-UTR区域存在-10和-35区启动子核心序列。靶基因预测分析发现，sRNA的47—54位可与barA基因mRNA的5′-UTR端-50—-57位碱基互补配对(图1)。

A.STM STnc1220基因克隆：M.DNA Marker DL2000；1.阴性对照；2.sRNA STnc1220基因。B.STM STnc1220基因的测序分析。C.sRNA STnc1220与靶基因barA的互补配对位置。A.STM STnc1220 gene clone：M.DNA Marker DL2000;1.Negative control;2.sRNA STnc1220 gene.B.Sequencing analysis of STM STnc1220 gene.C.Complementary pairing position of sRNA STnc1220 and target gene barA.

2.2 沙门菌 STnc1220基因缺失株的构建与鉴定结果

以pKD3质粒为模板，P3/P4引物扩增出的打靶片段为1 159 bp，与预期大小一致(图2-A)。以P1/P2引物扩增出的sRNASTnc1220、ΔSTnc1220∷cat、ΔSTnc1220片段大小分别为275 ，1 261，330 bp(图2-B)。PCR扩增及测序结果证明缺失株ΔSTnc1220构建成功。

A.STnc1220打靶片段：M.Marker DL2000；1.阴性对照；2.打靶片段。B.沙门菌ΔSTnc1220的鉴定：M.Marker DL2000；1.阴性对照；2.sRNA STnc1220基因；3.ΔSTnc1220∷cat扩增产物；4.ΔSTnc1220基因扩增产物。A.STnc1220 targeting fragment：M.Marker DL2000；1.Negative control；2.Targeting fragment.B.Identification of STM ΔSTnc1220:M.Marker DL2000；1.Negative control；2.sRNA STnc1220 gene；3. ΔSTnc1220∷cat amplification product；4.ΔSTnc1220 gene amplification product.

2.3 沙门菌 STnc1220基因缺失株生长与生化特性分析

PCR扩增结果显示，连续传代的第10，20，30，40，50代的细菌，其凝胶电泳扩增条带大小一致，表明缺失株沙门菌ΔSTnc1220具有良好的遗传稳定性(图3)。生长曲线结果表明，亲本株和缺失株在37 ℃培养条件下的生长速率基本相同，表明sRNASTnc1220基因缺失不影响鼠伤寒沙门菌的生长特性(图4)。缺失株ΔSTnc1220和亲本株的生化特性相同，证明sRNASTnc1220基因缺失不影响鼠伤寒沙门菌的生化特性。

图3 ΔSTnc1220遗传稳定性PCR验证Fig.3 Identification genetically stable of ΔSTnc1220 by PCR

图4 生长曲线测定Fig.4 Growth curve measurement

2.4 STnc1220基因缺失对沙门菌生物被膜形成的影响

生物膜形成结果显示，测得的野生株OD600为1.22，缺失株OD600为1.17，由此可知，野生株和缺失株生物膜形成能力差异不显著(P>0.05)，表明缺失株沙门菌ΔSTnc1220不影响生物被膜的形成。

2.5 STnc 1220基因缺失对沙门菌环境应激的影响

与亲本株相比，缺失株在pH=4.8、pH=9和含有2 mmol/L 30% H2O2条件下差异性不显著(P>0.05)；在4% NaCl的BHI液体培养基中，缺失株在7 h后生长速率明显高于亲本株(P<0.05)； 在含有3.8%乙醇的条件下，缺失株在4～8 h的生长显著高于亲本株(P<0.05)(图5)。

不同小写字母表示差异显著( P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

2.6 STnc1220基因缺失对沙门菌细胞黏附和侵袭能力的影响

与亲本株SL1344相比，缺失株ΔSTnc1220对细胞的侵袭率下降了88.66%；黏附率下降了62.76%，(图6)，提示STnc1220缺失后沙门菌细胞黏附和侵袭能力极显著降低(P<0.01)。

同组织间不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；不同组织间未做显著性分析。Different capital letters in the same tissue showed significant differences(P<0.01)；There was no significantly different analysis between different tissues.

2.7 STnc 1220基因缺失对沙门菌致病力的影响

沙门菌 SL1344和ΔSTnc1220的LD50分别是6.46×104，1.48×105cfu/mL，但缺失株小鼠生存时间明显延长(表2、图7)，表明缺失株沙门菌ΔSTnc1220毒力显著低于亲本株。解剖及观察组织切片发现，与PBS对照组相比，SL1344和ΔSTnc1220均出现明显的病理学变化(图8)。肝脏出现出血，边缘明显，组织学出现肝索排列不规则，窦状隙扩张，出现细胞核溶解，单核细胞浸润；脾脏明显肿大，出现红髓白髓界限模糊，红髓充血、散在性出血，白髓变小，有大量淋巴细胞浸润。与SL1344相比，ΔSTnc1220的组织病理学改变较轻，表明STnc1220基因缺失可降低沙门菌对小鼠器官的病理损伤能力。

表2 6周龄小鼠腹腔注射SL1344、ΔSTnc1220菌株后LD50的测定Tab.2 Determination of LD50 after intraperitoneal injection of SL1344 and ΔSTnc1220 strains in 6-week-old mice

图7 不同菌株感染小鼠死亡生存曲线Fig.7 Death and survival curve of mice by intraperitoneal infected with different strains

图8 SL1344、ΔSTnc1220感染小鼠脏器的病理学变化Fig.8 Pathological changes of organs in mice infected with SL1344 and ΔSTnc1220

3 结论与讨论

现有的研究发现，sRNA可通过碱基配对与靶mRNA相互结合，通过多种方式在转录后水平调控靶基因的表达，从而调节细菌的物质代谢、环境适应性、毒力等多个生理过程[14]。目前，已经发现的细菌sRNA对靶基因mRNA的调控主要包括以下几种：第一，sRNA与靶mRNA的结合，可增强靶基因mRNA稳定性，防止Rnase E对靶基因mRNA的降解，发挥正调控作用[15]。其次，sRNA与靶mRNA的结合形成双链后，可诱导Rnase Ⅲ的降解，对靶基因的表达发挥负调控作用[16]。第三，sRNA与靶mRNA的结合，可打开靶基因mRNA遮蔽核糖体结合位点(RBS)的二级结构，有利于核糖体30S与RBS的结合，从而促进靶蛋白的翻译。此外，sRNA可与靶mRNA上的RBS结合，抑制核糖体30S与RBS的结合，从而抑制靶蛋白的翻译[17]。Houserova等[14]研究鉴定了在沙门菌SL1344基因组中差异表达的475个sRNA，然而大部分sRNA 的生物学功能和致病性尚不清楚。Kim等[18]发现，sRNARaoN可抑制NADPH氧化酶介导的ROS产生，控制亚硝化氧化应激抗性。Chien等[19]验证了在厌氧环境下，sRNAFnrS可以通过与其靶基因碱基配对来抑制 mRNAMetE+基因的表达。陈斌杰等[20]发现，sRNARyhB可增强沙门菌的侵袭力进而调控沙门菌的毒力。Meng等[5]研究表明，sRNASTnc640可以调控肠炎沙门菌菌毛基因的表达，影响黏附来抑制沙门菌的毒力。由于沙门菌 sRNA对靶mRNA的调控方式具有明显的多样性，这可能也是沙门菌具有广泛的感染谱(能在多种动物体内生存繁殖)和较强的环境适应能力(耐酸和胞内生存)的重要原因之一。

在细菌中，许多 sRNA可以直接感知多种环境信号[10]。本研究结果显示，STnc1220的缺失后增强了对高渗、乙醇环境的适应能力，表明 sRNASTnc1220在对外界应激环境发挥了一定作用。同时，本研究通过RNAtarget 2软件预测出 sRNASTnc1220的47—54位碱基可和barAmRNA的5′-UTR端-50—-57位碱基互补配对，提示STnc1220调控的靶基因为barA。有研究发现，barA是入侵基因表达和细菌穿透上皮细胞所需的磷酸化类型的传感器激酶，与反应调节分子SirA构成了一个双组分调节剂，诱导SPI-1基因的表达以响应未知的细胞外信号[21]。Fortune等[22]研究证实ΔbarA对细胞的侵袭能力与亲本株相比显著降低；Altier等[23]发现，barA的缺失对入侵基因表达的调控显著降低。因此，本研究推测STnc1220可通过调控靶基因barA的表达来调节细菌的致病力，上述推测还需要通过进一步研究来证实。

总之，本研究通过λ-Red方法构建了沙门菌STnc1220基因缺失株ΔSTnc1220，验证了STM-ΔSTnc1220的部分生物学特性，证实STnc1220在沙门菌侵袭黏附细胞及致病力上发挥了重要的调控作用。