施肥对农田土壤碳氮磷化学计量特征及相关酶活变化的影响

平怀香，崔建宇，陈 硕，魏露露，陈 清，张德龙

(1.中国农业大学 资源与环境学院，北京 100193；2.上海农乐生物制品股份有限公司，上海 201419)

生态化学计量学利用生态学和化学计量学研究活性有机体及生态系统中碳氮磷(CNP)养分计量关系以探求其化学元素平衡和能量流通关系，可用来分析有机体的功能特性、生理行为等[1]和限制性养分元素的判定[2]。土壤有机碳、全氮、全磷比值作为评估土壤中养分状况的潜在指标[3]，可以准确判断土壤中有机质的分解程度、磷素矿化能力等，常用于自然生态系统的研究[4]。王晶苑等[5]探究了4种森林生态系统中植物与凋落物 CNP 比率。化学计量学在环境因子与生物体结构元素之间计量关系的应用也是屡见不鲜[6]。有研究对比了不同海拔山地雨林C/P和N/P[7]，以及不同植被区的土壤化学计量演变特征[8]。耕地土壤具有较大的空间异质性，使土壤中养分的化学计量特征更加复杂，微生物量也会相应发生变化，其中施肥方式是导致这种异质性的重要原因之一。有研究表明，长期有机无机肥配施条件下C/N值降低，磷肥施用下C/P值降低，撂荒处理N/P值则显著高于其他处理[9]。这可能是因为施肥改变了土壤酸碱度，抑制微生物生命活动，从而影响了土壤微生物量碳氮磷的化学计量学特征[10]。

土壤微生物量碳氮磷(MBC、MBN、MBP)参与养分有机-无机转化过程，表征土壤中物质代谢强度[10]。土壤微生物代谢和动植物残体分解产生的胞外酶能够参与土壤生化反应和物质循环过程，其活性也对农业管理措施存在响应，所以也经常用于指示土壤质量变化。不同的施肥制度会改变土壤微生物量、区系组成和代谢过程产生的酶数量和活性[11-16]。蔗糖酶活性反映土壤有机碳累积与分解转化规律[17]；磷酸酶将有机磷酯水解为无机磷后被植物利用；脲酶将酰胺态有机氮化物水解为无机氮，其活性高低取决于土壤微生物及土壤有机质含量，与土壤肥力密切相关；过氧化氢酶活性表征土壤总的生物学活性和肥力状况[18]。

在农田生态系统中，土壤养分-微生物量-土壤酶活性之间相互作用，联系紧密。但目前少有研究将土壤养分、微生物量化学计量比和相关酶活变化联系起来。本研究通过文献整合分析我国耕地土壤中不同施肥制度对土壤养分、微生物量CNP化学计量比和与之相关的土壤酶活变化之间的关系，探究施肥对土壤养分平衡关系的影响，明确土壤养分-微生物-酶活性体系对不同施肥制度的响应情况，旨在为科学施肥、减少化肥污染提供新思路。

1 材料和方法

1.1 数据收集

检索2000—2020年公开发表的关于耕地土壤施肥后养分变化情况的中英文数据库(中文数据库包括中国知网、万方数据库和百度学术，英文数据库为Web of Science)。中文检索关键词为“耕地土壤、施肥、微生物量碳氮磷、土壤酶活性、碳氮磷化学计量比”，英文检索关键词为“soil microbial biomass、CNP stoichiometry、soil enzyme activity、fertilizer”，获得相关文献328篇(中文文献63篇，英文文献13篇)。

直接从文献中获取不同施肥处理下作物成熟期土壤碳氮磷和微生物量化学计量比数据，或通过收集土壤性质的数据(土壤有机碳(SOC)、土壤全氮(TN)、土壤全磷(TP)、微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)、微生物生物量磷(MBP))，计算出质量比。由于各地施肥情况复杂，故将不同的施肥情况分为三类：单一化肥(SF，氮肥、磷肥、钾肥)、复合肥(CF，氮肥和磷肥、氮肥和钾肥、磷肥和钾肥、氮磷钾复合肥)、化肥有机肥配施(MF)。此外，还收集蔗糖酶、磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶活性。轮作制度、土地利用类型、土壤酸碱度也是影响施肥对微生物碳氮磷化学计量特征及酶活性的重要指标，故同时纳入数据库。

所纳入文献必须符合以下标准：

①只选择耕地土壤的试验，包括农田、温室大棚和盆栽等。②在肥料施用试验中只添加相应的肥料(氮磷钾肥、有机肥等)，不添加其他元素调理剂或罕见的改良剂。③报告了土壤碳氮磷、土壤微生物量碳氮磷、土壤酶活性或其中一种的平均值、样本量、标准误差或标准偏差。④主要包括作物成熟期采集的表层土壤(0～20 cm)的数据。⑤原始数据可以从原稿中获得(从图表中直接获取或通过GetData Graph Digitizer软件提取)，若原始数据中有机碳用有机质表示，则将土壤有机质除以1.724转化为有机碳含量。

去重后获得文献224篇，然后阅读文题和摘要进行初步筛选剩余116篇，阅读全文和质量评价后剩余文献76篇。

1.2 研究方法

统计学指标采用权重响应比(Response ratios，RR)表示，并计算其 95%的置信区间(95%CI)，计算公式为：

RR=Mt/Mc

①

式①中，Mt和Mc分别代表处理组和对照组的平均值。在分析过程中，需要将RR自然对数化：

②

另外，平均值的变异系数V(Variance)、权重(Weighted factor，Wij)、 权重响应比(Weighted response ration，RR++)、RR++的标准误(S)以及其 95%CI可按如下公式计算：

③

Wij=1/V

④

⑤

⑥

95%CI=RR++±1.96S(RR++)

⑦

式③中，SDt2和SDc2分别代表处理组和对照组的标准差；nt和nc分别代表处理组和对照组的样本数。式⑤中，m是分组数，ki是第i分组的总比较对数。95%CI可以通过(eRR++-1)×100%来转化，若95%CI全部大于 0，说明该变量对其因变量具有显著的正效应；若全部小于 0，说明该变量对其因变量具有显著的负效应；若包含 0，则说明该变量中处理与对照没有显著差异。

1.3 数据分析

试验数据利用Excel 2016进行基本处理和汇总，利用 MetaWin 2.1 软件进行整合分析，然后采用SPSS 22.0软件对数据进行单因素方差(ANOVA)分析，采用 Origin 2016 绘图。

2 结果与分析

2.1 施肥对农田土壤CNP化学计量特征的影响

不同施肥措施对土壤CNP化学计量关系均有一定影响(图1)，施用单一化肥、复合肥、化肥有机肥配施土壤中C/N平均值分别为14.1，14.8和23.2。化肥有机肥配施土壤中C/N显著高于化肥(单一或复合)；C/P平均值分别为20.4，15.3和14.8，与C/N呈相反趋势； N/P值普遍较低且无显著差异，范围在3.10～5.03，其中单一化肥(5.03)>复合肥(4.43)>化肥有机肥配施(3.10)。与施用单一化肥相比，化肥有机肥配施显著提高了土壤C/N(P<0.05)(图1)。

不同小写字母代表不同施肥的土壤C/N、C/P、N/P的差异显著性(P<0.05)。Different letters indicate significant difference(P<0.05)of C/N，C/P and C/P with different fertilization.

图2显示了不同土地利用类型、土壤酸碱度、轮作制度下施肥对土壤C/N、C/P、N/P的影响。不同土地利用类型中施肥对土壤C/P、N/P影响显著，尤其在水田中施肥会显著降低土壤C/P、N/P(P<0.05)。在酸性土壤中，施肥会提高C/N，在中碱性环境中，施肥则降低土壤C/N。对于C/P和N/P，无论是在酸性还是碱性土壤中，施肥都会导致其比值下降。一年两熟的轮作制度下施肥会显著降低土壤养分化学计量比，但这也可能是因为这种轮作制度对土壤环境的人为扰动较大，养分通过其他途径损失了一部分。

括号内数字为样本数。图4，6同。Numbers in brackets indicate the number of samples.The same as Fig.4，6.

2.2 施肥对农田土壤微生物量CNP化学计量特征的影响

施肥土壤的MBC/MBP值排序为：化肥有机肥配施>单一化肥>复合肥。化肥有机肥配施土壤MBC/MBP为57.4，与施用化肥时MBC/MBP差异显著(P<0.05)(图3)。单一化肥和复合肥土壤MBC/MBP也存在显著差异。不同施肥措施下MBC/MBN、MBN/MBP比值较低且无显著差异。

不同小写字母代表不同施肥处理MBC/MBN、MBC/MBP、MBN/MBP的差异显著性(P<0.05)。Different letters indicate significant difference(P<0.05)of MBC/MBN，MBC/MBP and MBC/MBP with different fertilization.

施肥土壤的微生物量化学计量比在不同土地利用类型、土壤酸碱度和轮作制度均存在显著差异(图4)。与不施肥相比，水田中施肥显著降低MBC/MBN(P<0.05)；旱地中施肥则显著降低MBC/MBP和MBN/MBP(P<0.05)。碱性环境下施肥土壤MBC/MBP、MBN/MBP与不施肥相比差异显著(P<0.05)。一年一熟时施肥显著降低MBC/MBP，一年两熟时施肥显著降低MBC/MBN，MBN/MBP在2种轮作制度下均显著降低。

图4 不同施肥制度、利用类型、土壤酸碱度和轮作制度下土壤MBC/MBN、MBC/MBP和MBN/MBP的权重响应比Fig.4 Weight response ration(RR++)of MBC/MBN，MBC/MBP and MBN/MBP with different fertilization，land use types，soil pH and rotation systems

2.3 施肥对农田土壤酶活性的影响

不同施肥制度均能提高土壤蔗糖酶、磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶活性，但增幅有所不同，蔗糖酶和脲酶活性增幅最大(图5)。与施用单一化肥相比，化肥配施有机肥显著提高土壤中蔗糖酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性，其中蔗糖酶活性增幅可高达100%。磷酸酶活性在单一化肥土壤中增幅为0.23 mg/(g·d)，在化肥有机肥配施土壤中增幅为0.65 mg/(g·d)。过氧化氢酶在不同施肥制度中活性稳定，增幅不超过0.28 mg/(g·d)。

不同小写字母代表不同施肥处理蔗糖酶、磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶增量的差异显著性(P<0.05)。Different letters indicate significant difference(P<0.05)of the increment of theactivities of sucrase，phosphatase，urease and catalase with different fertilization.

与不施肥相比，土地利用类型、土壤酸碱度和轮作制度均显著提高土壤酶活性。除了 pH>8和一年两熟条件下，施肥对过氧化氢酶活性无显著影响(图6)。

图6 不同施肥制度利用类型土壤酸碱度和轮作制度下土壤蔗糖酶、磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶活性的权重响应比Fig.6 Weight response ration(RR++)of sucrase，phosphatase，urease and catalase activities with different fertilization，land use types，soil pH and rotation systems

2.4 农田土壤养分化学计量-微生物量化学计量-土壤酶活性相关性分析

表1显示了土壤养分、微生物量和土壤酶活性的相关性。其中，有机碳(SOC)与微生物量碳氮磷均呈极显著正相关(P<0.01)，与磷酸酶呈极显著正相关(P<0.01)，与过氧化氢酶呈显著负相关(P<0.05)。全氮(TN)与微生物量碳氮磷和脲酶活性也呈极显著正相关(P<0.01)，其中与MBP的相关系数为0.85。全磷(TP)与MBN、MBP和脲酶活性呈极显著正相关，其中与MBP的相关系数为0.72。微生物量碳氮磷与土壤酶活性也具有一定的相关相关性。MBC与磷酸酶活性极显著正相关(P<0.05)；MBN与过氧化氢酶活性呈极显著正相关，与蔗糖酶、脲酶活性呈显著负相关(P<0.05)；MBP与过氧化氢酶活性呈极显著正相关，与脲酶活性呈显著正相关，与蔗糖酶活性呈极显著负相关。

表1 土壤养分、微生物量化学计量比和酶活性相关性Tab.1 Correlation between soil nutrients, stoichiometry ratio of microbial biomass, and enzyme activity

3 讨论与结论

3.1 不同施肥下土壤和微生物养分化学计量特征

不同施肥条件对土壤C/N、C/P、N/P均有影响，这与许多研究结果[3，9]一致。单一化肥和化肥有机肥配施分别对土壤C/N、C/P影响最大。单施氮肥可以向土壤提供大量的氮素，且外源氮磷肥的施用加速了土壤中稳定有机碳组分的分解，导致稳定碳库向活性碳库的转变[19]，更快地被作物利用，使得土壤中总有机碳减少。另一方面，化肥有机肥配施会改变土壤团粒结构和理化性质，为土壤中的微生物提供充足的碳源和能源，微生物数量和活性增强会加速土壤中有机碳的矿化分解。与化肥和不施肥处理相比，长期化肥有机肥配施C、N的积累速率比P的积累速率慢[4]，导致土壤磷积累过剩，降低了土壤C/N、C/P和N/P[3]。施加单一化肥提高土壤中N/P，N/P作为反映土壤磷素矿化能力的指标，其比值越高，说明磷的矿化能力越强。磷作为作物生长和微生物活动不可缺少的元素，其活性的提高有利于作物生长，且会提高微生物活性从而起到改良土壤的作用。

长期不同施肥处理下养分投入状况的差异，会对土壤微生物的养分供应造成不同程度的影响，从而影响微生物生物量碳氮磷的化学计量比[9]。王传杰等[9]研究结果表明，不同施肥制度下土壤MBC/MBP均显著低于撂荒处理，李春越等[10]研究也发现，长期施肥处理的MBC/MBP显著低于不施肥处理，这与荟萃分析结果一致。一方面，长期施肥使土壤酸化板结，通气性差，土壤C/N降低，土壤有机碳矿化加速而使得土壤中积累的有机碳量减少，而作物生长过程中消耗大量碳源却没有及时得到补充，微生物只能释放体内固持的碳素以供作物生长，导致MBC含量降低。但合理的化肥有机肥配施可以提高土壤养分的有效性和保水能力，为微生物提供丰富的碳源，从而提高MBC。Guo等[20]发现，有机肥处理下二氧化碳排放量、潜在矿化碳和周转速率常数显著增加。另一方面，因为磷肥的施用提供了一个富磷环境，这时微生物生长速率高。根据生长速率理论，微生物会促进富含磷元素的核糖体RNA运作。因此，不同施肥方式下MBC/MBP均降低。在农田生态系统中，长期单施有机肥(粪肥)和长期单施化肥时MBC、MBN与不施肥处理相比均略有增加，而在施用化肥基础上配合养分循环再利用，MBC、MBN均显著提高[21]。荟萃分析显示，施用单一化肥和化肥有机肥配施时MBC/MBN降低，而施用复合肥时MBC/MBN升高。这是因为无机氮肥和有机肥向土壤提供了大量的氮能够调节土壤氮素的供应能力，加强微生物对氮素的固持作用，而复合肥提供的营养较为均衡，这种优势作用则不明显。但是施肥对微生物量的影响还与肥料种类、施肥数量、施肥处理时间等有关[22]。长期施肥显著改变了微生物的整体功能结构。施用化肥显著增加了参与碳、氮、磷和硫循环的大多数基因的多样性和丰度[23]，这也是微生物量化学计量变化的原因之一。

水田和旱地是中国主要产粮区的2种主要农业生态系统。与自然生态系统相比，旱地通常会导致土壤碳和氮的流失，而水田由于长期处于淹水条件，限制了与有机物分解和C矿化相关的微生物活动，使其土壤碳积累量较高。密集的氮肥施用和缓慢的N矿化和微生物生物量周转是水田含N较高的原因。本研究中，水田和旱地这2种常见的利用方式对土壤养分化学计量比的影响模式相似，均降低了土壤C/N、C/P和N/P，这与Zheng等[24]的部分研究结果类似。在旱地，耕作会提高土壤孔隙度，增加通气和碳矿化造成高碳损失，而作物收获后残体不能就地返回也造成了低碳输入和高碳输出。同时，旱地土壤中密集的磷肥施用和较低的生物有效性使得大量磷素残留在土壤中。旱地土壤中的低碳和高磷含量是降低C/N、C/P和N/P的主要原因。淹水条件限制了水田中与较慢的有机质分解和秸秆碳矿化相关的微生物活动，促进了碳积累。但是集约化管理措施(氮和磷施肥、耕作、灌溉等)以及作物残留体的清除会干扰碳、氮的耦合，导致水稻土中氮和磷的积累高于碳，C/N和C/P相对较低。耕作制度与气候条件息息相关。热带和亚热带等较温暖和较湿润的地区通常为一年两熟，而一年一熟在暖温带和中温带地区(特点是温度和降雨量较低)更为常见。本研究中除了一年两熟会提高MBC/MBP外，不同轮作制度均会降低土壤养分和微生物量化学计量比，但一年两熟的土壤变化更加强烈。这是因为温暖潮湿地区初级生产力较高，母质高度风化，再加上磷淋失量较高，导致养分变化趋势大。不同pH值环境下土壤养分和微生物量化学计量比具有相同的变化趋势，说明pH值可能会通过调控土壤中的养分循环而影响微生物活动。尤其是长期施肥处理后土壤酸碱度发生变化，会对微生物的生命活动产生抑制作用[10]。

3.2 不同施肥下土壤酶活性变化及相关性分析

土壤酶主要来源于土壤微生物代谢和动植物的分解，土壤中的所有生化反应都是在土壤酶的参与下完成的，所以土壤酶活性水平可以反映土壤生物活性和土壤生化反应强度[25]。不同的施肥处理措施均提高了土壤中蔗糖酶、磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶活性，这与陈桂芬等[18]的研究结果一致。因为施肥，尤其是化肥配施有机肥可以改善土壤物理结构和通气性，为微生物提供一个适宜的生长繁殖条件，另外有机肥中的微生物释放的酶随着肥料一同进入耕地中，增加了土壤酶的数量，从而提高了土壤酶活性。柳开楼等[26]研究表明，化肥有机肥配施比化肥单施更有利于提高土壤酶活性，这与本研究中有机无机配施显著提高土壤蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性结果一致。

脲酶是表征土壤速效养分和作物养分吸收的关键酶活性因子[27-28]，不同施肥下脲酶活性的增量无显著差异，是因为在肥料投入的过程中首先要保证作物对N的需求，丰富的氮源使脲酶活性一直保持在较高水平。脲酶活性还与溶磷细菌数量密切相关[18]，本研究中，脲酶活性与TP和MBP呈显著正相关也间接证实了这一点。磷酸酶活性是反映土壤有机磷转化能力的指标，与土壤pH值关系密切，有机无机配施可通过调节土壤pH值来增加其活性。磷酸酶活性与土壤OC和MBC呈极显著相关性，说明土壤中C转化过程也影响其活性高低。蔗糖酶是水解酶，其活性高低反映土壤有机碳分解与转化的规律。因此，磷酸酶活性与蔗糖酶活性呈极显著正相关。过氧化氢广泛存在于土壤中对土壤具有一定的毒害作用，而土壤中的微生物和作物根系分泌的过氧化氢酶可以将其分解为水和氧气等无毒物质。本研究发现，施肥提高了过氧化氢酶活性，这与曲杰等[29]的结果不一致，这可能是由于土地利用类型、土壤酸碱度、轮作制度以及肥料用量和施肥时间不同造成的差异。但与其他酶活性相比，过氧化氢酶活性在不同施肥土壤中趋于稳定。过氧化氢酶活性与土壤磷素的转化关系密切，对土壤中氮素的转化也具有重要作用[30]，但过氧化氢酶活性与土壤TN和TP无显著相关性而与MBN、MBP呈极显著正相关，这说明影响过氧化氢酶活性的主要是土壤中的生物过程。

农田生态系统具有较大的空间异质性，土壤养分状况、微生物活动或酶活变化单一过程很难反映土壤质量状况、评估某一田间管理方式的科学性。土壤养分-微生物-酶活性体系搭建有助于理解土壤CNP大量元素的周转和循环，从而改善农业措施。

本研究通过数据整合分析，明确土壤和微生物量CNP化学计量特征及土壤酶活变化对不同施肥方式的响应。结果表明：①化肥有机肥配施能够显著影响土壤中CNP化学计量比，使其处于适合微生物活动的范围，促使微生物释放更多有利于土壤养分矿化的酶。因此，化肥有机肥配施可作为农业生产中提高作物产量并保证土壤健康的有效途径。②土壤酶活性受到土壤养分状况和微生物生物量周转过程的共同影响。③CNP化学计量比还受到土地利用类型、土壤酸碱度和轮作制度等因素的影响。肥料类型及施用量、土壤耕种年限等也是影响研究结果的重要因素，如果要得出更加精确的结论，还需结合各地实际情况。因此，本研究旨在从土壤-微生物-酶活性体系和化学计量比的角度为科学施用肥料提供一条新思路。