外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗抗氧化系统的影响

和秋兰，张 航，王正维，万丽嫱，海梅荣

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，云南 昆明 650201)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是世界第三大粮食作物，是我国第四大粮食作物[1-2]。我国是第一大马铃薯生产国，马铃薯种植区被划分为北方一作区、中原二作区、西南一二季混作区和南方冬作区4个区域[3]，作为西南一二季混作区之一的云南由于独特生态环境和气候条件，全年皆可种植和收获马铃薯[4]。马铃薯在云南的种植历史悠久，是云南非常重要的农作物，其常年播种面积在50.3万～66.7万hm2，云南马铃薯生产规模居全国第3位[4-5]。近年来农业气象灾害加重，发生频繁，特别是极端气候事件发生的频率加大，其中云南受到的低温冻害影响较为严重[6-8]。云南是高原季风气候，其气候类型具有多样性，在低纬度高海拔的地理条件影响下，云南的气候具有光照充足、干湿季分明、四季温差小、垂直变化显著等共同特点，这使云南适宜多种农作物和经济作物的栽培，但同时也使云南的干季和雨季过于集中且分布不均以及时常伴随低温冷冻、冰雹等灾害发生。在云南霜冻一般发生在11月到次年4月，以1—4月较多，而低温主要是指3—4月出现的“倒春寒”和“8月低温” (部分地区在9月)[9]。

低温胁迫根据胁迫程度的不同，可将低温胁迫分为冷害和冻害，低温胁迫会造成植物形态改变、呼吸代谢失调、光合作用减弱、细胞膜系统受损、氧化酶系统代谢紊乱，甚至造成植物死亡[10-11]。有研究者指出，马铃薯幼苗生长的温度底线为5～7 ℃，在-0.5～-0.8 ℃时会受冷害，在-2 ℃下会受到冻害；在-4 ℃下会整株死亡[12]。低温胁迫会对马铃薯的生长造成危害，从而严重影响马铃薯的产量：首先，低温胁迫使马铃薯细胞膜系统受损，具体表现为低温胁迫会破坏细胞内外的离子平衡而改变马铃薯细胞膜的透性，马铃薯通过提高不饱和酸的数量和比例来维持膜的流动性从而抵抗低温胁迫，但随着胁迫时间的延长或者胁迫程度的加重，细胞内活性氧与自由基的含量会明显增多，同时使保护酶体系的活性降低，导致活性氧以及自由基的积累使细胞膜脂过氧化反应发生，并积累过氧化产物丙二醛(MDA)，从而使生物膜透性增强，进而对植物的生长发育造成损伤[13-15]。其次，低温胁迫使马铃薯渗透调节物质改变，具体表现为低温胁迫会促进植物通过增加可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸的含量由此抵抗胁迫，且其含量与不同马铃薯品种的冷驯化能力和抗寒能力呈正相关[15-16]。再次，低温胁迫使马铃薯保护酶活性改变，具体表现为低温胁迫使马铃薯幼苗叶片中的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性提高，随着胁迫时间的延长和胁迫程度的加重，保护酶活性总体上会表现为先急剧升高后降低，再缓慢提高的过程[17-18]。最后，低温胁迫会抑制马铃薯的光合作用，具体表现为光饱和点、光补偿点、气孔导度和蒸腾速率等的显著降低[19]。

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺，Melatonin，MT)是一种具有较强生物活性的天然物质，广泛存在于动植物体中，在高等植物中，褪黑素被证实是一种类似于植物激素的信号分子，参与多个生理过程的调控，例如种子萌发、光合作用、开花、昼夜节律、成熟和衰老以及对环境胁迫的响应等[20-22]，研究表明，褪黑素能够提高植物对病害、干旱、盐碱、紫外、高温、低温、重金属离子等胁迫的抗性[23]。就低温胁迫而言：100～150 μmol/L MT能较优的促进低温胁迫条件下番茄幼苗株高、茎粗、叶面积的增加；有效提高番茄幼苗叶片SOD、POD、CAT的活性，降低MDA含量和细胞膜的透性、显著提高番茄幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸含量，由此提高番茄幼苗抗低温胁迫的能力；有研究者推测MT可能是通过上调SlZAT2/6/12而引起CBF1基因表达从而提高番茄果实耐寒性[24-25]。50～200 μmol/L MT处理可有效提高低温胁迫条件下茄子幼苗叶片中SOD、POD、CAT等的活性，提高抗坏血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)、脯氨酸(Pro)和可溶性蛋白(SP)含量，显著抑制茄子叶片MDA、超氧阴离子及过氧化氢(H2O2)的积累，从而提高茄子幼苗对低温胁迫的耐性[26]。

为了探究施加MT能否提高马铃薯耐低温胁迫的能力，本试验以云南主栽马铃薯品种合作88为材料，采用模拟低温胁迫的方法，研究外源MT对马铃薯幼苗生长和抗氧化系统的影响，为云南马铃薯栽培提供理论参考，同时探索出外源MT诱导马铃薯幼苗耐低温的最佳浓度，为外源添加MT缓解马铃薯低温胁迫提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试材及处理

1.1.1 试验材料 云南主栽马铃薯品种合作88。

1.1.2 试验地概括 本试验于云南省昆明市北郊(25°08′N，102°45′E)云南农业大学后山大棚进行盆栽试验，该试验地海拔1 966 m。

1.1.3 马铃薯培育 本试验于2020年8—12月进行。首先，将已催芽的马铃薯切块(0.1%高锰酸钾消毒)，保证每个切块有至少一个芽眼并控制其质量约为50 g；其次，将马铃薯播种于6.0 cm×7.0 cm×8.8 cm(底部直径×高度×顶部直径)的塑料营养钵中，以蛭石和泥炭土(1∶1)混合物为基质；最后，将播种的马铃薯置于托盘内，放于大棚进行培养，其间在托盘中加入适量的1/5霍格兰营养液，马铃薯出苗后保持托盘内均有适量营养液。

1.1.4 试验处理 选择生长相对一致的株高为(15±1)cm的马铃薯幼苗，在托盘中分别加入0，50，100，150 μmol/L的MT溶液，后将其移至低温光照培养箱进行冷驯化(4 ℃白天/4 ℃晚上，光照12 h)14 d，然后在-2 ℃进行低温胁迫12 h，其间维持托盘内有适量的MT溶液。低温胁迫后的马铃薯叶片进行混合取样，同时以常温培养的马铃薯幼苗作为对照，进行生理生化指标的测定。MT购买于北京索莱宝生物科技有限公司，MT溶液的配制方法如下：分别称取0.011 6，0.023 2，0.034 8 g用少量90%乙醇溶解所称取的褪黑素，加入1/5霍格兰营养液定容到1 L，即可配置成50，100，150 μmol/L的褪黑素溶液。

1.2 测定方法

1.2.1 生长指标测定 本试验测定的生长指标包括：存活率、株高和茎粗，其中马铃薯幼苗的存活率=(所有叶片和茎秆冻死的幼苗数/供试幼苗总数)×100%；株高采用直尺测定，茎粗用游标卡尺测定。

1.2.2 生理生化指标测定 本试验测定的生理生化指标包括：丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)，上述指标均使用苏州格锐思生物技术有限公司的试剂盒测定，其中MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法；Pro采用酸性茚三酮比色法；POD活性采用愈创木酚法；SOD活性采用WST-8显色法。

1.3 数据统计及分析

本试验的数据采用Excel 2010和SPSS 17.0进行统计及分析。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗生长的影响

2.1.1 对马铃薯幼苗形态及存活率的影响 图1是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗表型的影响，从图1可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，马铃薯的生长受到明显的抑制，受损程度轻的幼苗叶片呈水渍状，受损程度较高的幼苗叶片及茎秆萎蔫，甚至死亡。外源MT可不同程度的影响马铃薯幼苗在低温胁迫下的生长状态。

图1 外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗表型的影响Fig.1 Effect of exogenous melatonin on potato phenotype under low temperature stress

图2是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗存活率的影响。从图2可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，马铃薯的存活率下降了50百分点，50，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗较单独低温胁迫提高了38.89，27.78百分点，表明外源MT在一定程度上可以提高马铃薯幼苗在低温胁迫下的存活率。

WT.常温对照；LT.低温对照；LT+50MT.低温胁迫下添加50 μmol/L褪黑素；LT+100MT.低温胁迫下添加100 μmol/L褪黑素；LT+150MT.低温胁迫下添加150 μmol/L褪黑素。不同字母表示不同处理具有显著差异(P<0.05)。图3—14同。

2.1.2 对马铃薯幼苗株高及茎粗的影响 图3是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗株高的影响，从图3可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗的株高显著降低，其降低了40.25%。与单独的低温胁迫相比，50，100，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗的株高分别提高了2.92%，16.97%，5.62%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗株高降低，外源MT的施加可提高马铃薯幼苗的株高。

图3 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗株高的影响Fig.3 Effects of exogenous melatonin on plant height of potato under low temperature stress

图4是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗茎粗的影响，从图4可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗的茎粗降低了6.57%。50，100，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗的茎粗分别提高了1.86%，2.82%，13.20%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗的茎粗减少，外源MT的施加可以增加幼苗茎粗。

图4 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗茎粗的影响Fig.4 Effects of exogenous melatonin on stem diameter of potato under low temperature stress

2.2 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗膜脂过氧化的影响

图5是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片H2O2含量的影响，从图5可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片中的H2O2含量提高，其提高了13.63%。与单独的低温胁迫相比，100 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片H2O2的含量降低了0.48%。图6是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片MDA含量的影响，从图6可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片中的MDA含量显著提高，其提高了81.59%。与单独的低温胁迫相比，100，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片MDA含量分别降低了19.35%，9.45%。表明低温胁迫提高了H2O2的产生速率，使得膜脂过氧化反应发生，进而造成MDA的积累，外源MT的施加，可以在一定程度上缓解马铃薯幼苗由低温胁迫造成的膜脂过氧化伤害。

图5 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片H2O2含量的影响Fig.5 Effects of exogenous melatonin on H2O2 content in leaves of potato under low temperature stress

图6 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片MDA含量的影响Fig.6 Effects of exogenous melatonin on MDA content in leaves of potato under low temperature stress

2.3 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗渗透调节物质的影响

图7是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片可溶性糖含量的影响。从图7可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片中的可溶性糖含量显著增加，其增加了50.00%。与单独的低温胁迫相比，50 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片可溶性糖含量提高了12.66%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗会通过增加可溶性糖的积累来抵抗低温胁迫，50 μmol/L MT的施加可进一步增加可溶性糖的积累，从而减轻低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。

图7 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片可溶性糖含量的影响Fig.7 Effects of exogenous melatonin on SS content in leaves of potato under low temperature stress

图8是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响，从图8可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片中的可溶性蛋白含量增加，其增加了10.55%。与单独的低温胁迫相比，50 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片可溶性蛋白含量提高了13.80%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗会通过增加可溶性蛋白积累来抵抗低温胁迫，50 μmol/L 外源MT的施加可进一步增加可溶性蛋白的积累，从而减轻低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。

图8 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响Fig.8 Effects of exogenous melatonin on SP content in leaves of potato under low temperature stress

图9是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片脯氨酸含量的影响，从图9可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片中的脯氨酸含量显著增加，其增加了95.57%。与单独的低温胁迫相比，50，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片脯氨酸含量分别提高了1.96%，38.70%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗会通过增加脯氨酸的积累来抵抗低温胁迫，外源MT的施加可进一步增加脯氨酸的积累，从而减轻低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。

图9 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片脯氨酸含量的影响Fig.9 Effects of exogenous melatonin on Pro content in leaves of potato under low temperature stress

2.4 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗抗氧化酶的影响

图10是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片SOD活性的影响，从图10可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片的SOD活性显著提高，增加了82.39%。与单独的低温胁迫相比，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片SOD活性提高了52.61%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗会通过提高SOD的活性来抵抗低温胁迫，150 μmol/L MT可显著提高马铃薯幼苗SOD的活性，从而减轻低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。

图10 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片SOD活性的影响Fig.10 Effect of exogenous melatonin on SOD activity in leaves of potato under low temperature stress

图11是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片POD活性的影响，从图11可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片的POD活性显著提高，其增加了99.75%。与单独的低温胁迫相比，50，100，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片POD活性分别提高了29.24%，55.44%，25.25%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗会通过提高POD的活性来抵抗低温胁迫，施加外源MT可提高马铃薯幼苗POD的活性，从而减轻低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。

图11 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片POD活性的影响Fig.11 Effect of exogenous melatonin on POD activity in leaves of potato under low temperature stress

图12是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片CAT活性的影响，从图12可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片的CAT活性显著降低，其降低了61.56%。与单独的低温胁迫相比，50，100，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片CAT活性显著提高，其分别提高了351.62%，213.56%，300.94%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗CAT活性降低，外源MT的施加可显著提高马铃薯幼苗CAT的活性，减轻低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。

图12 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片CAT活性的影响Fig.12 Effect of exogenous melatonin on CAT activity in leaves of potato under low temperature stress

2.5 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗抗氧化剂的影响

图13是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片AsA含量的影响，从图13可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片AsA含量提高，其增加了14.12%。与单独的低温胁迫相比，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片AsA含量分别提高了3.48%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗会通过增加AsA的积累来对抗低温胁迫，150 μmol/L MT可以增加AsA的积累，从而进一步减轻低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。

图13 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片AsA含量的影响Fig.13 Effects of exogenous melatonin on AsA content in leaves of potato under low temperature stress

图14是外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片GSH含量的影响，从图14可以看出，经冷驯化及低温胁迫后，与WT相比，马铃薯幼苗叶片GSH含量提高，其增加了7.48%。与单独的低温胁迫相比，100，150 μmol/L MT处理使马铃薯幼苗叶片GSH含量分别提高了13.61%，3.97%。表明在低温胁迫下，马铃薯幼苗会通过增加GSH 的积累来对抗低温胁迫，100，150 μmol/L MT可以提高GSH的积累，从而进一步减轻低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。

图14 外源褪黑素对低温胁迫下马铃薯幼苗叶片GSH含量的影响Fig.14 Effects of exogenous melatonin on GSH content in leaves of potato under low temperature stress

3 讨论与结论

低温胁迫会抑制植物的生长，本试验中，与WT相比，低温胁迫抑制马铃薯幼苗的生长在株高上表现最为明显，符合植物抵抗低温胁迫的应答[27]。MDA的含量被用来衡量膜脂过氧化程度，本试验结果表明，在低温胁迫下马铃薯幼苗的MDA和H2O2含量升高，说明低温胁迫下马铃薯幼苗的细胞膜系统被破坏，使膜脂过氧化反应的发生。施加100 μmol/L MT，H2O2含量低于单独的低温胁迫，说明外源MT降低膜脂过氧化程度，进而对低温胁迫下马铃薯幼苗的细胞膜起到保护作用。渗透调节物质的含量可作为植物耐低温胁迫的指标，一般认为可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸的含量与植物的抗寒性呈正相关。在低温胁迫下，植物通过积累渗透调节物质来调节细胞渗透势，以维持正常的细胞膜结构和各种酶类物质的正常功能，在本试验中，低温胁迫下马铃薯幼苗叶片中的SS、SP和Pro的含量增加，50 μmol/L MT处理使可溶性糖和可溶性蛋白的含量显著提高，150 μmol/L MT处理使脯氨酸的含量显著提高，表明适宜浓度的MT可以促进渗透调节物质的积累，通过调节SS、SP、Pro的含量来降低细胞渗透势，以缓解低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害。低温胁迫下，植物通过提高抗氧化酶的活性来清除植物体内活性氧自由基，从而缓解活性氧对细胞膜的伤害，缓解低温胁迫对植物的伤害，在本试验中，低温胁迫下马铃薯幼苗的SOD和POD的活性提高，CAT活性下降，表明马铃薯幼苗主要通过SOD和POD来降低活性氧的积累，150 μmol/L MT处理显著提高SOD的活性，100 μmol/L MT处理显著提高POD的活性，50，100，150 μmol/L MT处理显著提高CAT的活性，表明外源MT的施加可以提高低温胁迫下马铃薯幼苗叶片抗氧化酶的活性，促进自由基的清除，从而缓解低温胁迫对马铃薯的伤害。在本试验中，低温胁迫下马铃薯幼苗叶片的MDA和H2O2含量、渗透调节物质(SS、SP和Pro)的积累、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)的活性以及因外源施加MT的改变与低温胁迫下外源MT 对黑麦草[28]、大白菜[29]、茄子[30]、油菜[31]、烟草[32]、草莓[33]、番茄[24]等植物的MDA和H2O2含量的作用相似。

AsA和GSH是重要的抗氧化剂，其对维持蛋白质的稳定性，生物膜系统结构的完整性及防御膜膜脂过氧化起重要作用[34]。在本试验中，在低温胁迫下马铃薯幼苗叶片中的AsA和GSH含量提高，外源MT的施加可以提高低温胁迫下马铃薯幼苗的抗氧化剂含量，这与低温胁迫对草莓叶片抗氧化剂含量的变化一致[35]。

本试验结果显示：50 μmol/L MT可能通过提高低温胁迫下马铃薯幼苗的株高和茎粗、增加SS、SP、Pro的积累、提高POD和CAT的活性来缓解低温胁迫对植株的伤害，从而提高马铃薯幼苗的存活率；100 μmol/L MT 处理使马铃薯幼苗的存活率下降；150 μmol/L MT可能通过提高马铃薯幼苗的株高和茎粗、增加Pro、AsA和GSH的积累、提高SOD、POD和CAT活性来缓解低温胁迫对植株的伤害，从而提高马铃薯幼苗的存活率。由此可见，50，150 μmol/L MT均能提高马铃薯幼苗抵抗低温胁迫的能力，但是基于幼苗存活率和成本因素等的考虑，50 μmol/L MT是较优的选择。

综上，低温胁迫抑制马铃薯幼苗的株高，降低幼苗存活率，但对幼苗的茎粗影响不显著；造成叶片H2O2和MDA 的含量升高进而对幼苗的膜系统造成损伤；提高叶片SS、SP、Pro、AsA、GSH的含量和SOD、POD的活性来应对低温胁迫。施加外源MT后可以不同程度的提高幼苗的存活率和株高、降低叶片的MDA和H2O2含量、进一步促进SS、SP、Pro、AsA、GSH的积累和增强SOD、POD、CAT的活性，从而维持细胞膜结构和各种酶类物质的正常功能，缓解低温胁迫对马铃薯幼苗的伤害，进而提高马铃薯幼苗的抗低温胁迫的能力，其中50 μmol/L MT是较优的选择。