香辛料提取物及其主效成分对煎制猪肉中杂环胺生成的影响

李星雨，徐筱莹，雷秋琪，易阳,3，王宏勋,3，王丽梅,3*

(1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，武汉 430023；2.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023；3.湖北省生鲜食品工程技术研究中心，武汉 430023)

杂环胺(heterocyclic aromatic amines，HAAs)是一种高度致癌、致突变的有害物质[1-2]，易在鱼类和家禽类等富含蛋白质的动物组织高温烹饪过程中生成[3]，是一类由碳、氢和氮3种原子组成，并通过美拉德反应与自由基机制生成的芳香族化合物[4]。最初是在经过明火煎烤或油炸处理后的鱼类和家禽类肉制品中被检测到，之后又在经高温处理过的高蛋白质食物中逐渐发现了20多种杂环胺[5]。人们通过食用这些含有杂环胺的食物，在体内积累有害物质，从而导致各种疾病的出现[6-7]。

香辛料是天然食用植物香料的统称，是一种天然的植物源防腐剂，可从植物的果实、花瓣、叶和根茎等组织获取，具有浓烈的芳香味和辛香味[8]。它是天然植物类的调味品，具有香、辛、甜、麻、苦、辣等多种气味[9]。天然香辛料在肉制品加工过程中经常被使用，经研究证明其不仅可以使肉制品具有特征风味，还对肉制品加工过程中杂环胺的生成有重要影响[10]。香辛料的主要功能性组分为酚类、辛辣味物质和精油等。酚类物质具有良好的抗氧化活性；辛辣型香辛料中的辛辣味成分大多为酰胺类物质，如辣椒素和胡椒碱等[11-13]，辣椒素可以促进脂肪的氧化，增加能量的释放[14]，具有较好的降血脂、降肝脂作用[15]，胡椒碱可降低人体内血液中胆固醇和脂肪含量，还有抗惊厥[16]、抗癌[17]的作用；精油具有良好的抑菌效果[18]；香辛料中还包含脂肪族化合物，如肉桂醛，对于调节肉制品的风味具有重要影响[19]。丁香酚、肉桂醛、胡椒碱、桉油精分别为丁香、桂皮、黑胡椒和草果中的主效成分[20-21]。根据实验室前期研究结果[22]，选取丁香、桂皮、花椒、草果、黑胡椒5种抗氧化活性好的香辛料和其主效成分(肉桂醛、丁香酚、桉油精、胡椒碱)，采用HPLC法对猪肉的煎制条件和杂环胺的提取条件进行优化，并对添加香辛料及其主效成分的煎制猪肉中杂环胺进行检测，考察5种香辛料和主效成分对杂环胺的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

猪肉(长约6 cm、宽约5 cm、厚约5 cm的里脊肉)：购于武商量贩超市，肥肉较少；5种香辛料丁香、桂皮、花椒、草果、黑胡椒：均购于武汉舵落口香料市场；5种香辛料主效成分辣椒素、肉桂醛、丁香酚、桉油精、胡椒碱：均购于上海源叶公司；9种杂环胺标准品9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Norharman)、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Harman)、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-p-1)、2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(MeIQ)、2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,7,8-TriMeIQx)：均购自加拿大Toronto Research Chemicals公司；Oasis 3cc MCX(60 mg)固相萃取柱：购于厦门艾普锐公司；ZORBAX SB-C18色谱柱：购于上海生析公司；冰醋酸、甲醇、乙腈：均为色谱纯；氨水、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、醋酸铵等：购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SB-5200DTN超声波清洗器、XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；A360紫外可见分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司；AR2140电子分析天平 奥斯特仪器有限公司；TG18M高速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；Milli-Q Academic去离子纯水机 美国Millipore公司；BSA223S分析天平 德国Sartorius公司；MF-06多功能电锅煲 德国德朗公司；EVA50氮吹仪 北京绿绵巨贸公司；Agilent 1260高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HPLC检测条件的建立

参考姚瑶[23]的方法并稍作修改，配制5种杂环胺的标准溶液，按照质量浓度由低到高进样，绘制标准曲线。

HPLC色谱检测条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 mL/min；进样量A：20 μL；柱温：30 ℃；采用二元流动相体系：流动相为乙腈，流动相B为0.05 mol/L 醋酸-醋酸胺缓冲液(pH 3.6)；4,7,8-DiMeIQx、MeIQx、MeIQ和IQ通过紫外检测器在263 nm波长激发下检测。荧光检测器根据所检测杂环胺的保留时间进行编程。

流动相梯度及荧光检测器的波长见表1。

表1 流动相梯度及荧光检测器的波长Table 1 The mobile phase gradient and fluorescence detector wavelength

1.3.2 煎制猪肉中杂环胺的提取纯化

采用盐酸法[24-25]分离提取杂环胺，稍作修改。准确称取20.00 g里脊肉，使用模具将肉块制为肉饼，取单恬恬等提取的丁香、桂皮、花椒、草果和黑胡椒水提物，梯度稀释为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%(W/W)，加入到猪肉饼中进行腌制，每面各1 h，以空白加水腌制的猪肉饼作为对照组。将腌制好的猪肉饼放入煎锅中，在220 ℃下每面煎制3 min后取出。取煎制猪肉样品4 g(精确到0.01 g)剪碎后于50 mL离心管中，加入甲醇∶0.1 mol/L盐酸(1∶4)提取液25 mL，用均质器均质(15 s×4次)之后，室温下超声提取15 min。取出离心管，在转速4000 r/min下离心10 min；取上清液，加入5%三氯乙酸沉淀蛋白质，过滤后离心，取上清液，并用4 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.0。

固相萃取柱预先依次用6 mL甲醇、0.1 mol/L盐酸、超纯水活化；再加入样品，加入上述相同的溶液除杂，弃去流出液；加入甲醇∶氨水为95∶5(体积比)的6 mL溶液洗脱出杂环胺，用氮吹仪吹干洗脱液，加入0.5 mL甲醇复溶，并用0.22 μm的尼龙针孔滤器过滤，转入高效液相色谱进样瓶中，进行高效液相色谱检测。从检测结果中选取杂环胺抑制效果较好的香辛料，将其主效成分以浓度梯度 0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%进行腌制，并按照相同的方法处理后进行杂环胺的测定。

1.3.3 杂环胺提取条件优化

分别考察25 mL的 0.1 mol/L盐酸、0.15 mol/L盐酸、0.2 mol/L盐酸、甲醇∶0.1 mol/L盐酸(1∶4，V/V)、甲醇∶0.15 mol/L盐酸(1∶4，V/V)、甲醇∶0.2 mol/L盐酸(1∶4，V/V)6种不同的提取液对煎制猪肉样品中杂环胺的提取效果，通过比较杂环胺的检出种类和检出总量选取杂环胺提取效果最好的溶剂。

1.3.4 猪肉煎制条件优化

实验考察在220 ℃下煎制2，4，6，8，10 min(双面煎制)5个时间，180，200，220，240 ℃ 4个温度下煎制6 min对杂环胺生成量的影响，通过比较其失重率、杂环胺生成量，观察肉质品表面以及肉质成熟程度来确定猪肉煎制的最佳时间和最佳温度。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂对杂环胺检测的影响

由表2可知，6种提取液的杂环胺提取效果有显著差异(P<0.05)。利用0.2 mol/L 盐酸提取液提取仅检测出4,8-DiMeIQx 1种杂环胺，但杂环胺总量比检测出3种杂环胺的0.15 mol/L 盐酸提取液要高。0.15 mol/L 盐酸∶甲醇(1∶4)和0.2 mol/L 盐酸∶甲醇(1∶4)均检出4种杂环胺，杂环胺总量分别为82.74，97.04 ng/g。0.1 mol/L 盐酸∶甲醇(1∶4)可检测出MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP、Norharman和Harman 5种杂环胺，检出的杂环胺总量达到115.71 ng/g。因此，选用0.1 mol/L 盐酸∶甲醇为1∶4作为杂环胺的提取溶剂。

表2 不同提取溶剂对煎制猪肉中杂环胺检测的影响 Table 2 The effects of different extraction solvents on the detection of HAAs in fried pork

2.2 煎制条件对煎制猪肉中杂环胺生成的影响

2.2.1 煎制时间对杂环胺生成的影响

由表3可知，随着煎制时间的增加，煎制猪肉中杂环胺的种类及含量有显著变化(P<0.05)。在温度相同的条件下，杂环胺总量在逐渐增加，从8.79 ng/g增加至122.82 ng/g，失重率也逐渐变高，从18.34%增加至61.23%。煎制时间为2 min时，肉品表面还有红色血水，杂环胺总量小于10.00 ng/g；煎制时间为6 min时，猪肉已煎熟，表面略有焦黄色，肉质较为柔软，失重率为42.43%，符合平时家中食用猪肉的质感，杂环胺总量为118.35 ng/g；煎制时间为10 min时，失重率高达61.23%，肉质很硬，肉品表面干涩，且有大量焦黑物质，杂环胺生成量最高，为122.82 ng/g。根据综合评价，选择煎制6 min(双面煎制)为最佳时间，既满足猪肉饼日常煎制感官、食用要求，又使得杂环胺总量不至于过高。

表3 煎制时间对煎制猪肉的失重率和杂环胺总量的影响Table 3 The effects of frying time on weight loss rate and total amount of HAAs in fried pork

续 表

2.2.2 煎制温度对杂环胺生成的影响

由表4可知，在煎制时间相同的条件下，均检测出MeIQx、4,8-DiMeIQx、Norharman、MeIQ和PhIP 5种杂环胺。且随着温度的升高，杂环胺的总量有显著的增加(P<0.05)，从78.00 ng/g增加至103.03 ng/g。在4个温度下煎制6 min，猪肉样品均已煎熟，200 ℃与180 ℃相比较，表面略多些焦黄物质，杂环胺总量相差不大；当温度升至220 ℃时肉品表面略有焦黑，肉质柔软，MeIQ、MeIQx 和 PhIP均有显著增加(P<0.05)，分别为67.17，24.52，2.64 ng/g，检出的杂环胺总量为 97.80 ng/g；温度为240 ℃时，肉品表面存在大量焦黑物质，且杂环胺总量最高，达到103.03 ng/g。但家庭日常使用煎制温度并未达到240 ℃，因此煎制温度选用220 ℃，肉品感官较好。夏新武[26]研究发现烘烤温度、烘烤时间和牛肉尺寸等加工条件都会显著影响烘烤的牛肉制品中杂环胺的含量和种类，并且随着烘烤时间的增加、烘烤温度的升高，杂环胺的含量及种类也会随之增加，与本实验结论一致。

表4 煎制温度对煎制猪肉中杂环胺总量的影响Table 4 The effects of frying temperature on total amount of HAAs in fried pork

2.3 5种香辛料水提物对煎制猪肉中杂环胺生成的影响

2.3.1 丁香水提物对杂环胺生成的影响

由图1可知，丁香水提物对煎制猪肉中MeIQx无抑制作用，当浓度从0.05%增加至0.15% 时，MeIQx含量从40.21 ng/g升至46.78 ng/g，增加8.74%。随着浓度的增加，其他4种杂环胺的抑制率随之升高。其中对4,8-DiMeIQx和PhIP的抑制作用最为显著(P<0.05)，抑制率最高可达51.58%和89.35%；对于Harman和Norharman，0.20%浓度的丁香水提物才有显著的抑制效果。

图1 丁香水提物对杂环胺生成的影响Fig.1 The effect of clove water extracts on the production of HAAs

2.3.2 桂皮水提物对杂环胺生成的影响

由图2可知，桂皮水提物对煎制猪肉中MeIQx的生成无明显抑制作用，杂环胺含量有明显波动，与浓度无对应关系。对其他4种杂环胺均具有显著的抑制效果(P<0.05)，且随着浓度的增加，抑制率大多也随之升高。其中桂皮水提物对PhIP和4,8-DiMeIQx的抑制效果最为显著(P<0.05)，抑制率最高可达100%和72.68%。

图2 桂皮水提物对杂环胺生成的影响Fig.2 The effect of cinnamon water extracts on the production of HAAs

2.3.3 花椒水提物对杂环胺生成的影响

由图3可知，花椒水提物对Harman、Norharman、PhIP均无明显抑制效果，曲线平缓，杂环胺含量无明显变化。对4,8-DiMeIQx的生成具有显著的促进作用(P<0.05)，当浓度为0.15%时，相比于空白组，4,8-DiMeIQx含量从48.43 ng/g增加至77.09 ng/g，增加59.18%；对MeIQx的生成有显著的抑制效果(P<0.05)。当浓度为0.30%时，MeIQx含量从43.02 ng/g降至28.46 ng/g，抑制率为33.85%。

图3 花椒水提物对杂环胺生成的影响Fig.3 The effect of Chinese prickly ash water extracts on the production of HAAs

2.3.4 黑胡椒水提物对杂环胺生成的影响

由图4可知，黑胡椒水提物仅检测出煎制猪肉中4种杂环胺。黑胡椒水提物对MeIQx的生成无明显抑制作用，且对4,8-DiMeIQx、Harman的抑制效果较弱；对Norharman有显著的抑制作用(P<0.05)，且随着浓度的增加，抑制效果越好，当浓度为0.30%时，抑制率高达74.55%。

图4 黑胡椒水提物对杂环胺生成的影响Fig.4 The effect of black pepper water extracts on the production of HAAs

2.3.5 草果水提物对杂环胺生成的影响

由图5可知，草果水提物仅检测出煎制猪肉中4种杂环胺。草果水提物对Norharman有不同程度的促进作用，促进作用最高，为34.29%；对 MeIQx无明显的抑制作用，仅MeIQx 在浓度为0.30%时有较好的抑制作用，抑制率为22.94%；对4,8-DiMeIQx和Harman的生成有显著的抑制作用，抑制率最高可达22.94%和53.98%。

图5 草果水提物对杂环胺生成的影响Fig.5 The effect of Amomum tsaoko water extracts on the production of HAAs

不同种类的香辛料对杂环胺有不同的抑制效果。姚瑶等[27]发现丁香、桂皮、良姜、红花椒和香叶对酱牛肉中杂环胺生成的影响具有特异性。邵斌[28]发现丁香对鸡肉中PhIP具有较强的抑制效果，与本实验结论相似。另外，其他香辛料对杂环胺也有一定的抑制作用。万可慧[29]发现经过八角和花椒处理后的肉制品中检测出的杂环胺含量较多，经良姜和桂皮处理后检测出的杂环胺相对较少，加入良姜后AαC、Norharman和PhIP的生成量明显减少。吕美[30]研究香辛料添加浓度为3%时对煎制牛肉饼中杂环胺生成的影响，发现对PhIP抑制作用最强的是高良姜，抑制率可达到100%，对Norharman和AαC的抑制率均超过77%，但加入桂皮和陈皮却促进了PhIP的生成。

2.4 香辛料主效成分对煎制猪肉中杂环胺生成的影响

2.4.1 丁香酚对杂环胺生成的影响

由图6可知，丁香酚对煎制猪肉中的4种杂环胺均有显著的抑制效果(P<0.05)，且随着浓度的升高，杂环胺的抑制效果越明显。当浓度从0.01%增加至0.05%时，MeIQx和MeIQ的曲线有显著的下降趋势(P<0.05)，抑制效果极佳，升至0.06%时，下降趋于平缓，抑制率分别为64.28%、67.39%。对4,8-DiMeIQx、Norharman均有显著的抑制效果(P<0.05)，当浓度为0.03%时，下降趋势明显，随着浓度的增加，抑制效果逐渐稳定，当浓度为0.05%时，抑制效果最好，对4,8-DiMeIQx和Norharman的抑制率分别为76.96%、89.58%。

图6 丁香酚对杂环胺生成的影响Fig.6 The effect of eugenol on the production of HAAs

2.4.2 肉桂醛对杂环胺生成的影响

由图7可知，肉桂醛在浓度为0.01%时，对煎制猪肉中MeIQx有显著抑制效果(P<0.05)，抑制率达到32.11%，在浓度为0.06%时也有一定的抑制效果，抑制率为14.34%，其他浓度抑制效果不明显。对MeIQ亦有显著的抑制效果(P<0.05)，当浓度为0.05%时，抑制效果最佳，抑制率为24.40%。检测出4,8-DiMeIQx、Norharman含量较低，随着浓度的增加，肉桂醛对其均有促进作用。当浓度为0.06%时，4,8-DiMeIQx、Norharman的含量分别增加50.32%、80.35%，Norharman含量增加了接近1.5倍。

图7 肉桂醛对杂环胺生成的影响Fig.7 The effect of cinnamaldehyde on the production of HAAs

2.4.3 胡椒碱对杂环胺生成的影响

由图8可知，胡椒碱对4,8-DiMeIQx、Norharman均有显著的抑制效果(P<0.05)，在浓度为0.05%时，杂环胺抑制率分别为60.48%、70.15%；对MeIQ也有显著的抑制效果(P>0.05)，其含量有一定的波动，但有下降的趋势，当浓度为0.06%时，含量从39.03 ng/g降至31.01 ng/g，抑制率达到20.52%，且每个浓度间有显著性差异(P<0.05)；在浓度为0.01%时，对煎制猪肉中MeIQx有显著的抑制效果，含量从12.13 ng/g 降至7.16 ng/g，其他浓度相对于空白组无明显抑制作用。张梦茹[31]选用了3种辛辣型香辛料(胡椒、花椒和辣椒)及其所含酰胺类特征成分(胡椒碱、花椒麻素和辣椒素)，研究它们对烤牛肉饼中杂环胺生成的影响，结果显示胡椒碱在浓度较低时，能有效抑制4,8-DiMeIQx和IQx的生成，但随着胡椒碱浓度的增加，对杂环胺的抑制效果会逐渐变弱，与本实验结论相似。

图8 胡椒碱对杂环胺生成的影响Fig.8 The effect of piperine on the production of HAAs

2.4.4 桉油精对杂环胺生成的影响

由图9可知，桉油精对煎制猪肉中4种杂环胺均有显著的抑制效果(P<0.05)，且大部分浓度越高，对杂环胺的抑制效果越好，杂环胺含量有显著的下降趋势(P<0.05)。对MeIQx、MeIQ均有显著的抑制效果，在浓度为0.05%时，抑制效果最佳，含量分别从17.06 ng/g降至11.46 ng/g，从30.44 ng/g降至19.58 ng/g，抑制率分别为32.78%、35.69%。对4,8-DiMeIQx、Norharman均有较好的抑制效果，且在浓度为0.05%时效果最佳，抑制率分别为46.31%、44.10%。

图9 桉油精对杂环胺生成的影响Fig.9 The effect of eucalyptol on the production of HAAs

3 结论

实验优化出猪肉煎制的最佳条件为：煎制时间6 min(双面煎制)、煎制温度220 ℃，最符合日常生活中的肉制品烹饪条件；杂环胺提取溶剂为甲醇∶0.1 mol/L盐酸25 mL(1∶4，V/V)，检出的杂环胺总量最高。本实验的5种香辛料中，丁香水提物及其主效成分的抑制效果最为显著，丁香水提物对Norharman、4,8-DiMeIQx、Harman、PhIP均有显著抑制作用，最佳抑制率分别为56.41%、51.58%、50.11%、89.35%；主效成分丁香酚对MeIQx、MeIQ、4,8-DiMeIQx、Norharman的抑制率分别为64.28%、67.39%、76.96%、89.58%，具有良好的开发前景。香辛料的水提物和其主效成分对煎制猪肉中杂环胺的形成均有影响，说明香辛料抑制杂环胺形成的作用与其主效成分有关；但其影响程度不同，说明不完全是主效成分起作用，可能是香辛料中还含有其他可抑制杂环胺形成的物质或者是众多组分之间协同作用，抑制了杂环胺的生成，同时可以探究多种香辛料同时添加对杂环胺生成的影响。从研究结果可以得出，在煎制猪肉过程中可考虑添加含有丁香或丁香酚的香辛料。杂环胺的生成是一个复杂的过程，本文中香辛料的抑制效果与其抗氧化活性基本一致，但杂环胺的生成不全是由于自由基起作用，为进一步阐明杂环胺生成的抑制机理，后续可通过利用化学模型体系，探究香辛料对杂环胺生成的影响和抑制机制。