不同方法提取山桐子油的品质及体外抗氧化活性研究

宋明发，杨芸，白冉冉，梁芳芳，章乾，陈高飞，许粟，马立志,3*

(1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵阳 550025；2.贵阳学院 食品与制药工程学院，贵阳 550005；3.贵州省果品加工工程技术研究中心，贵阳 550005)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim.)是大风子科，落叶乔木植物，又称为水冬瓜、油葡萄、椅桐等，是油材两用树种[1]，分布于中国、日本、朝鲜等地[2]，山桐子是木本植物油料，有“树上的油库”的美誉，其果肉占总重的62.3%，种子占总重的36.7%[3]。山桐子果实含油率为36.71%[4]，山桐子中脂肪酸的成分主要有油酸、亚油酸[5]等，具有降血脂、降血压、软化血管等保健作用，还具有抗氧化能力和免疫能力[6]，山桐子中含有大量的天然活性成分，主要成分是甾醇和生育酚的同系物，β-谷甾醇的含量高达28.15%[7]，可应用于工业用油、医药、化妆品、肥料[8]等行业。

目前，提取油脂的方法主要有压榨法提取、水酶法提取[9]、超声波辅助提取[10]、溶剂浸提提取[11]、超临界CO2萃取[12]等，华婉等[13]研究山桐子的提取工艺，得出通过压榨提取山桐子油，其出油率为21%；王玉琴等研究水酶法提取山桐子油，优化得出提取率可达93.88%；刘春雷等[14]优化索氏提取山桐子油工艺，结果表明，优化后的提油率为28.50%；田潇潇等[15]对山桐子油的抗氧化能力进行研究，结果表明ABTS自由基清除方面，果肉油为312.85 μmol TE/100 g，种子油为675.77 μmol TE/100 g，说明山桐子油具有抗氧化性。

本文以压榨法、水酶法、有机溶剂浸提法分别提取山桐子油，对比3种不同提取方法在品质及脂肪酸组成上的差异，为后续山桐子油的精炼提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

山桐子鲜果：采于四川省古蔺县。石油醚、异丙醇、95%乙醇、乙醚、冰乙酸、甲醇、正己烷、丙酮(均为分析纯)：天津市富宇精细化工有限公司；α-淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶(均为BR)：北京奥博星生物技术有限公司；无水硫酸钠、氢氧化钠、硫代硫酸钠(均为分析纯)：成都金山化学试剂有限公司；百里香酚酞、碘化钾(均为分析纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；可溶性淀粉(AR)：天津市永大化学试剂有限公司；韦氏试剂(AR)、2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、维生素C：上海阿拉丁生物科技有限公司；三氯甲烷(AR)：国药集团化学试剂有限公司；重铬酸钾(AR)：重庆川江化学试剂厂；氢氧化钾(AR)：重庆川东化工(集团)有限公司；37种脂肪酸甲酯混标：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 主要仪器与设备

CS-2000高速多功能粉碎机 永康市天祺盛世工贸有限公司；CZR309榨油机 广州德海威工业设备有限公司；N-1300旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；ZD-2A自动电位滴定仪 上海埃依琪实业有限公司；13型紫外分光光度计、202-1AB电热恒温干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；WSL-2型罗维朋比色计 杭州大成光成仪器有限公司；GC-2014气相色谱仪 岛津企业管理(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 压榨法提取山桐子油

将山桐子鲜果放入80 ℃烘箱中处理10 h，直接放入榨油机，通过高温压榨提取山桐子油，对压榨油脂进行离心，取出上清液油，底部废渣去除。

1.3.2 水酶法提取山桐子油

将山桐子干果按上述压榨前处理后，放入粉碎机中，将山桐子干果打细，过20目筛，称取一定量的山桐子过20目筛干粉，按料液比1∶4加入纯净水，搅拌均匀，加热至90 ℃进行杀菌5 min，冷却至46 ℃左右，将料液混合液的pH调至5，添加复合酶(纤维素酶、α-淀粉酶、果胶酶、木瓜蛋白酶为1∶1∶1∶1，混合均匀后，在酶解温度46 ℃下酶解4 h。酶解结束，于95 ℃水浴条件下灭酶5 min，在5000 r/min条件下离心20 min，吸取上层油。

1.3.3 有机溶剂浸提法提取山桐子油

将山桐子鲜果放入80 ℃烘箱中处理10 h，把山桐子干果打细并过20目筛，称取一定量的山桐子过20目筛干粉，加入不同料液比1∶10的有机溶剂石油醚(60～90 ℃)，在温度45 ℃下反应62 min，将料液混合液进行抽滤，滤液通过旋转蒸发仪浓缩去除有机溶剂，收集山桐子油。提油率计算公式如下：

式中：A1表示山桐子油的恒定质量(g)；A0表示所用山桐子干果粉末的质量(g)。

1.3.4 理化指标的测定

本次实验中，过氧化值的测定参照GB 5009.227-2016，酸价的测定参照GB 5009.229-2016，碘值的测定参照GB/T 5532-2008，皂化值的测定参照GB/T 5534-2008，不皂化物的测定参照GB/T 5535.2-2008，色泽的测定参照GB/T 22460-2008。

1.3.5 脂肪酸组成分析

样品的制备：参照GB 5009.168-2016。甲酯化处理：称取山桐子油0.03 g放置在试管中，加入体积比为1∶1的苯-石油醚(沸程60～90 ℃)混合试剂2 mL，溶解样品，待样品完全溶解后，加入0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液2 mL，涡旋混匀，放入43 ℃的恒温水浴反应35 min[16]，反应结束后，加入5 mL纯净水，静置40 min(待上清液澄清即可)，取上清液，用正己烷对上清液稀释10倍，稀释液经过无水硫酸钠，去除上清液中残留的水分，使用0.4 μm有机滤膜进行过滤，将滤液进样，待机检测。气相色谱条件：气相色谱柱为SH-Rt-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，检测器：FID检测器，采用程序升温，初始温度130 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升高至240 ℃，并保持20 min。

1.3.6 抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基清除率的测定：参照常晨等[17]的测定方法。

0.0001 mol/L DPPH溶液：称取0.0039 g DPPH自由基，使用无水乙醇定容至100 mL容量瓶中。

测定方法：在含刻度试管中分别加入4 mL DPPH和1 mL不同质量浓度样品(4， 6， 8， 10， 12， 14 mg/mL)，使用涡旋振荡器混匀，在室温条件下，避光放置30 min，以无水乙醇为调零液，在517 nm处测定吸光度，为A1；同时以VC作阳性对照，浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg/mL VC溶液代替样品，为A2，并分别作空白实验和样品对照组实验，按下列公式计算DPPH自由基清除率：

式中：A0为样品空白组(DPPH+无水乙醇)吸光度；A1为样品组(DPPH+样品)吸光度；A2为样品对照组(无水乙醇+样品)吸光度。

1.3.6.2 ABTS自由基清除率的测定

ABTS自由基清除率的测定：参照王芳等[18]的测定方法。

7 mmol/L ABTS溶液：称取0.3840 g ABTS，使用无水乙醇定容至100 mL容量瓶中；配制2.45 mmol/L过硫酸钾溶液：称取0.0648 g过硫酸钾，用无水乙醇定容至100 mL容量瓶中；ABTS混合工作液：将7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，放置在4 ℃冰箱中过夜14 h，使用时用无水乙醇将其稀释至吸光度为0.7～1。

测定方法：山桐子油样品不同质量浓度分别为4，6，8，10，12，14 mg/mL；阳性对照VC不同质量浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL；在刻度试管中加入4 mL稀释好的ABTS混合液，分别加入0.5 mL不同质量浓度的山桐子油样品，避光室温反应6 min，以无水乙醇为调零液，在734 nm处测定其吸光度值，为A1；以VC作阳性对照，浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg/mL VC溶液代替样品，为A2；并作空白实验和样品对照组实验，按下列公式计算ABTS自由基清除率:

式中：A0为样品空白组(ABTS混合液+无水乙醇)吸光度；A1为样品组(ABTS混合液+样品)吸光度；A2为样品对照组(无水乙醇+样品)吸光度。

1.3.6.3 羟基自由基清除率的测定

羟基自由基清除率的测定：参照周婷等[19]的测定方法，采用水杨酸比色法。

配制9 mmol/L FeSO4·7H2O溶液：称取0.2502 g FeSO4·7H2O，用纯水定容至100 mL；配制9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液：称取0.1243 g水杨酸，用无水乙醇定容至100 mL；配制9 mmol/L H2O2溶液：量取0.091 mL 30% H2O2至100 mL容量瓶中，用纯水定容。

测定方法：在刻度试管中加入不同质量浓度(0.4，2，4，6，8，10 mg/mL)的山桐子油1 mL，依次加入1 mL FeSO4溶液、1 mL水杨酸-乙醇溶液，再加入1 mL H2O2溶液，摇匀，此时将试管移入37 ℃水浴锅中反应30 min，反应结束后，以无水乙醇作为调零液，在510 nm处测定其吸光度，为A1；同时作阳性对照，取不同质量浓度(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL)的Vc溶液代替山桐子油，在相同条件下，测定其吸光度值，为A2。按下列公式计算羟基自由基清除率:

式中：A0为样品空白组(FeSO4+水杨酸-乙醇溶液+H2O2+无水乙醇)吸光度；A1为样品组(样品+FeSO4+水杨酸-乙醇溶液+H2O2)吸光度；A2为样品对照组(样品+FeSO4+水杨酸-乙醇溶液+纯水)吸光度。

1.4 数据处理

利用Origin软件作图，得到的数据以平均值±标准差表示，采用SPSS软件中Duncan分析对数据进行统计分析及差异性检验(显著水平P=0.05)。

2 结果与讨论

2.1 不同方法提取山桐子油提油率的比较

由图1可知，压榨法、水酶法、浸提法提取山桐子油的提油率分别为20.90%(与华婉等研究的压榨法提油率21.00%基本一致)、20.54%、28.47%(与刘春雷等研究的索氏提取法提油率28.50%基本一致)，浸提法>压榨法>水酶法，浸提法相对于压榨法和水酶法存在显著性差异(P<0.05)，从提取得率来看，浸提法提取的山桐子油出油率最高，但存在一定的溶剂残留。

图1 不同方法提油率的比较Fig.1 Comparison of oil extraction rate by different methods

2.2 山桐子油的抗氧化能力

2.2.1 山桐子油DPPH自由基清除率的比较

由图2和图3可知，压榨法、水酶法、溶剂浸提法3种方法的DPPH自由基清除率都随着山桐子油浓度的增加而升高，当山桐子油的质量浓度为10.00 mg/mL时，压榨法对DPPH自由基的清除率达51.45%，水酶法达63.05%，溶剂浸提法达33.11%，但Vc的质量浓度为0.04 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达95.60%。对于DPPH自由基的清除能力，水酶法>压榨法>浸提法，3种方法DPPH自由基清除能力的IC50值为浸提法15.83 mg/mL>压榨法9.63 mg/mL>水酶法7.25 mg/mL>Vc 0.02 mg/mL，水酶法对DPPH自由基的清除能力最强，优于吕秋兵等研究的冬瓜籽油(IC50值为10.23 mg/mL)对DPPH自由基的清除能力。

图2 山桐子油对DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of Idesia polycarpa Maxim. oils

图3 Vc对DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of Vc

2.2.2 山桐子油ABTS自由基清除率的比较

由图4和图5可知，压榨法、水酶法、溶剂浸提法3种方法提取的山桐子油对ABTS自由基的清除能力都随着山桐子油浓度的增加而显著升高，当浓度达到14.00 mg/mL时，压榨法清除率达到93.33%，水酶法清除率达到95.65%，溶剂浸提法清除率仅达74.03%，对ABTS自由基的清除能力明显低于压榨法及水酶法，Vc浓度仅为0.04 mg/mL时，清除率高达99.28%。通过计算，3种方法对ABTS自由基清除能力的IC50值大小依次为溶剂浸提法9.69 mg/mL>压榨法6.68 mg/mL>水酶法3.94 mg/mL>Vc 0.01 mg/mL，可以看出，水酶法在3种提取方法中对ABTS自由基的清除能力最强，显著高于压榨法及溶剂浸提法。

图4 山桐子油对ABTS自由基的清除能力Fig.4 ABTS radical scavenging capacity of Idesia polycarpa Maxim. oils

图5 Vc对ABTS自由基的清除能力Fig.5 ABTS radical scavenging capacity of Vc

2.2.3 山桐子油羟基自由基清除率的比较

由图6和图7可知，压榨法、水酶法、溶剂浸提法对羟基自由基的清除能力都随着山桐子油浓度的增加而逐渐升高。当山桐子油和Vc浓度都为0.40 mg/mL时，压榨法清除率为24.81%，水酶法清除率达22.59%，溶剂浸提法清除率达19.73%，Vc清除率高达55.66%，通过计算，3种方法对羟基自由基清除能力的IC50值大小依次为水酶法1.99 mg/mL>溶剂浸提法1.86 mg/mL>压榨法1.82 mg/mL>Vc 0.34 mg/mL，可以得出，压榨法对羟基自由基的清除能力较水酶法与溶剂浸提法显示最强。

图6 山桐子油对羟基自由基的清除能力Fig.6 ·OH radical scavenging capacity of Idesia polycarpa Maxim. oils

图7 Vc对羟基自由基的清除能力Fig.7 ·OH radical scavenging capacity of Vc

半抑制浓度IC50表示当自由基的清除率为50%时所需要抗氧化物质的质量浓度，IC50越小，说明该物质对自由基的清除能力越强，在清除DPPH自由基方面，清除能力大小顺序依次为：水酶法>压榨法>溶剂浸提法；在清除ABTS自由基方面，清除能力顺序依次为：水酶法>压榨法>溶剂浸提法；在清除羟基自由基方面，清除能力顺序依次为：压榨法>溶剂浸提法>水酶法。相对于清除DPPH和ABTS自由基，山桐子油对羟基自由基的清除率最高，说明油中含有大量酚类物质，这与含氧自由基羟基自由基的吸收能力呈正相关，从而对羟基自由基有更强的清除作用。

2.3 不同方法提取山桐子油理化指标的比较

油脂的酸价是衡量油脂酸败和新鲜程度及游离脂肪酸含量的重要指标，酸价越低，分解的甘油三酯越少，油脂的品质越好，由表1可知，压榨法、水酶法、溶剂浸提法3种方法提取的山桐子油酸价分别为1.75，2.51，1.99，水酶法的酸价较高，由于山桐子粉末在水解体系中反应，加快脂肪酸的水解，使得游离脂肪酸产生。过氧化值是反映油脂的酸败和氧化程度的重要指标，压榨法、水酶法、溶剂浸提法提取山桐子油的过氧化值分别为0.06，0.01，0.02，压榨法>溶剂浸提法>水酶法，水酶法与压榨法和溶剂浸提法之间差异性显著(P<0.05)，高温会使得油脂发生氧化，提高油脂的过氧化值，同时会使油中的抗氧化物损失或发生氧化[20]，水酶法提取油脂条件温和，其氧化程度最低。碘值反映油脂的不饱和程度，碘值越高，说明油脂的不饱和程度越高，油中不饱和脂肪酸含量高，压榨法与水酶法差异不显著；皂化值高低反映油脂中游离脂肪酸分子量大小，皂化值高，说明油脂游离脂肪酸分子量小；不皂化物包括自然界中脂类物质，如甾醇、烃类、醇类、脂肪族类等，表1中压榨法、水酶法、溶剂浸提法提取山桐子油不皂化物含量分别为1.28，1.09，1.81，溶剂浸提法>压榨法>水酶法；从色泽上看，红值中压榨法>溶剂浸提法>水酶法。

表1 不同方法提取山桐子油理化指标分析

2.4 不同方法提取山桐子油脂肪酸组成的比较

由表2可知，不同方法提取的山桐子油所含脂肪酸成分基本一致，都是由饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸组成，这与王玉琴等对山桐子品质分析的研究基本一致，压榨法、水酶法、浸提法的饱和脂肪酸分别为16.58%、16.72%、16.70%，水酶法>浸提法>压榨法；压榨法、水酶法、浸提法的不饱和脂肪酸分别为82.70%、82.56%、82.52%，压榨法>水酶法>溶剂浸提法；压榨法、水酶法、溶剂浸提法所含亚油酸分别为73.50%、73.50%、73.52%，显著高于刘丽娜[21]研究的落葵籽油亚油酸含量22.06%。

表2 不同方法提取山桐子油脂肪酸组成分析Table 2 The fatty acid composition analysis of Idesia polycarpa Maxim. oils by different extraction methods

3 结论

本文研究不同方法提取山桐子油及对油脂品质的影响，采用压榨法、水酶法、溶剂浸提法提取山桐子油，压榨法、水酶法、有机溶剂浸提法提取山桐子油得率分别为20.90%、20.54%、28.47%；浸提法的提取率最大，不皂化物含量最高，但耗时长，存在一定溶剂残留；水酶法提取的山桐子油红值最小，过氧化值最低，但耗时长，操作不便，压榨法酸价、碘值、不皂化物高于水酶法，且提油耗时短，操作简单。抗氧化结果表明，DPPH自由基清除能力大小顺序：水酶法>压榨法>溶剂浸提法；ABTS自由基清除能力大小顺序：水酶法>压榨法>溶剂浸提法，羟基自由基清除能力大小顺序：压榨法>溶剂浸提法>水酶法。水酶法的DPPH、ABTS自由基清除能力最强，IC50值分别为7.25，3.94 mg/mL；压榨法的羟基自由基清除能力最强，其IC50值为1.82 mg/mL。通过GC分析，压榨法、水酶法、浸提法提取山桐子油不饱和脂肪酸所含成分一致，但含量各有不同，压榨法82.70%、水酶法82.56%、溶剂浸提法82.52%，压榨法>水酶法>浸提法，因此，综合考虑选取压榨法提取山桐子油，为油料企业选择提取山桐子油的方法提供了理论参考。