结直肠癌患者血浆外泌体中miR-590-3p的表达及其临床意义

段吉舫 杨朝纲 向贤慧

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围内其发病率和死亡率分别位居所有恶性肿瘤的第三位和第二位［1］。目前尽管CRC患者预后有所改善［2］，但是其早期诊断手段仍有限，确诊时大部分患者伴淋巴转移或远处转移，导致治疗效果欠佳［3］。因此仍需寻找新的诊断及预后评估生物标志物，以制定个体化治疗策略，改善患者临床结局。外泌体检测作为新兴的“液体活检”技术，具有便捷、非侵入性且可以动态检测等优势［4］。微小RNA（microRNA，miR）是外泌体中含量最丰富的生物活性物质，在外泌体介导的恶性肿瘤发生发展中扮演着重要角色［5］，检测血浆外泌体miRNAs的表达水平也可用于辅助评估患者预后［6］。miR-590-3p是一种癌症相关非编码RNA，已被发现与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关［7-8］。研究报道，miR-590-3p可通过靶向抑制WIF1和DKK1激活Wnt/β-catenin信号通路促进结肠癌细胞的增殖［7］。近期研究发现，肿瘤相关成纤维细胞来源的外泌体miR-590-3p可通过诱导CRC细胞放疗抵抗，从而促进其进展与转移［9］。然而，血浆外泌体来源的miR-590-3p在CRC患者中的表达及其与预后的关系尚未清楚。基于此，本研究拟通过检测CRC患者血浆外泌体中miR-590-3p的表达水平，并分析其与患者临床病理特征和预后的关系，以期阐明miR-590-3p在CRC中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

回顾性收集2015年1月至2015年12月在利川市人民医院、武汉大学中南医院住院并接受手术治疗的97例CRC患者的血浆样本。所有患者均于术前收集晨起空腹外周静脉血5 mL，30～60 min内进行离心处理，分离血浆并保存于-80℃中备用。同时，收集我院体检中心同期20名健康人的血浆样本作为对照。患者纳入标准：⑴经病理确诊为结直肠腺癌；⑵术前均未接受放疗、化疗等抗肿瘤治疗；⑶术后病理分期为Ⅱ～Ⅲ期，且接受以5-氟尿嘧啶为基础的术后辅助放/化疗；⑷具有完整的临床病理资料。排除标准：⑴术前已转移或接受姑息性切除术；⑵5年内有其他恶性肿瘤病史；⑶伴有感染，或妊娠者。本研究中健康人群符合以下定义：⑴年龄＜35周岁；⑵全身体检（包括胃肠镜）结果正常。本研究经利川市人民医院和武汉大学中南医院医学伦理委员会批准（伦理编号：2015137；2015012），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要材料及仪器

主要材料：ExoQuick Exosome Precipitation Solution试剂盒（System Biosciences，USA），BCA试剂盒（碧云天，中国），TSG101、CD63和Calnexin抗体（Abcam，USA），miRNeasy serum/plasma micro kit（Qiagen，Valencia，CA，USA），synthetic C.elegans miRNA 试剂（Applied Biosystems，USA），TaqMan miRNA assays试剂盒（Applied Biosystems，USA），cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，USA），RT primer（广州锐博生物科技有限公司，中国），SYBR Green PCR Master Mix（Applied BiStudioystems，USA）；主要仪器：透射电子显微镜（FEI Tecnai G2 Spirit，Thermo science，USA），NanoSightLM10（MalvernInstrumentsInc.，UK），ChemiDoc MP全能型凝胶成像分析系统仪器（Bio-Rad，USA）。

1.3 研究方法

1.3.1 外泌体提取和鉴定 采用ExoQuick Exosome Precipitation Solution试剂盒并根据说明书分离血浆中的外泌体。取血清样本500 μL，加入126 μL ExoQuick试剂，上下颠倒混匀后置于4℃冰箱中孵育30 min，然后于室温下以1 500 g离心30 min，去除上清液后加入200μLPBS缓冲液混匀重悬，最终获得血浆外泌体悬液。

采用透射电镜鉴定血浆外泌体，观察外泌体形态，简要步骤如下：将外泌体滴入铜网，用2%磷钨酸复染2 min。风干15 min后，置于80 kV透射电子显微镜中进行观察，典型的外泌体形态通常为茶托型或一侧凹陷的半球形；采用NanoSight LM10检测外泌体的粒径，简要步骤如下：提取的外泌体经PBS重悬后，用无菌0.22 μm滤器过滤，然后利用无菌水对其进行1∶3 000稀释，约稀释为1 mL悬液，上样进行分析，具体参照仪器说明书进行。

1.3.2 Western blot法检测外泌体特异性标记蛋白TSG101、CD63的表达水平 提取外泌体中的总蛋白，应用BCA试剂盒检测蛋白浓度。配制10%分离胶和5%浓缩胶，电泳转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭后，孵育鼠抗人TSG101、CD63和Calnexin抗体（稀释比例为1∶1 000），4℃孵育过夜；TBST缓冲液洗涤3次后，滴加兔抗鼠二抗，室温摇床孵育1 h；再用TBST缓冲液洗涤3次，将PVDF膜置于ChemiDoc MP全能型凝胶成像分析系统仪器中扫膜，用Image Lab软件系统处理图像。以Calnexin为阴性对照。实验重复3次。

1.3.3 RT-qPCR法检测血浆外泌体中miR-590-3p的表达水平 采用miRNeasy serum/plasma micro kit试剂盒提取外泌体中的RNA，通过在每个血浆样本中添加25 fmol的synthetic C.elegans miRNA试剂（cel-miR-39）进行样品均一化。然后，利用TaqMan miRNA assays试剂盒检测血浆外泌体中miR-590-3p的表达水平，主要步骤如下：取1 μg RNA按照cDNA逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），加入SYBR Green PCR Master Mix，进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃、10 min预变性；95℃、15 s变性；60℃、1 min退火延伸，45个循环进行扩增，每个样品重复3次。引物序列：miR-590-3p（F序列为5′-AAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGG-3′，R序列为5′-CAGCUAGAUUGUAAGCUCCUUUU-3′）；cel-miR-39（5′-GGTCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3′）。以celmiR-39为内参，结果以2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.3.4 资料收集及随访 通过医院电子病历系统收集患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况、淋巴脉管浸润情况及TNM分期等临床病理资料。采用电话随访或门诊复诊等方式进行随访，术后2年内每3个月随访1次；术后2～5年每半年随访1次；术后5年后每年随访1次，随访截止时间为2020年12月31日。记录患者的总生存期（overall survival，OS），OS定义为自确诊之日至患者死亡或最后1次随访日期。

1.3.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据分析。采用χ2检验分析血浆外泌体中miR-590-3p与患者临床病理特征的关系；采用Kaplan-Meier计算生存率并绘制生存曲线，Log-rank检验比较组间生存率；采用单因素Cox回归分析与CRC患者OS相关的因素，将单因素分析差异有统计学意义的因素纳入多因素Cox回归模型分析影响CRC患者OS的独立危险因素。以双侧P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆外泌体的鉴定

透射电镜扫描显示，正常健康人和CRC患者血浆中的外泌体均呈现典型的囊泡状结构，且单位体积CRC患者血浆外泌体中的数目明显多于健康对照组（图1A～B）；NanoSight分析结果显示，正常健康人和CRC患者血浆外泌体呈不规则的布朗运动，粒径在50～200 nm之间，其中多数集中在100 nm左右，1 mL肿瘤患者血浆中的外泌体数目约为8×106个，明显多于同等体积健康对照组的5×106个（图1C）；Western blot检测结果显示，健康对照组和CRC患者血浆外泌体均表达CD63和TSG101，而不表达骨架蛋白Calnexin，且CRC患者血浆外泌体中的CD63和TSG101表达强度明显高于健康对照者（图1D）。

图1 CRC患者及健康对照者血浆外泌体的鉴定Fig.1 Identification of plasma exosomes from CRC patients and healthy controls

2.2 血浆外泌体miR-590-3p表达水平与CRC患者临床病理特征的关系

RT-qPCR检测结果显示，CRC患者血浆外泌体中miR-590-3p的表达水平明显高于健康对照组（7.163±0.147vs1.339±0.161，P＜0.001），见图2。以血浆外泌体中miR-590-3p表达水平的中位数（5.18）为界，将97例CRC患者分为高表达组和低表达组进一步分析，结果显示，血浆外泌体miR-590-3p高表达与肿瘤分化程度差、淋巴结转移数量多、淋巴脉管浸润阳性及TNM分期晚有关（均P＜0.05），见表1。

图2 CRC患者及健康对照者血浆外泌体中miR-590-3p的表达水平Fig.2 Expression of miR-590-3p in plasma exosomes from CRC patients and healthy controls

表1 血浆外泌体miR-590-3p表达水平与CRC患者临床病理特征的关系（n=97）Tab.1 Relationship between plasma exosomal miR-590-3p expression level and clinicopathological characteristics of patients with CRC(n=97)

2.3 血浆外泌体miR-590-3p表达水平与CRC患者预后的关系

至随访结束，中位随访时间为53个月，失访9例，死亡49例（其中低表达组16例，高表达组33例）。Kaplan-Meier生存分析显示，血浆外泌体miR-590-3p高表达组CRC患者的1、3、5年生存率分别为100.0%、55.1%、32.7%，低表达组分别为100.0%、83.3%、66.7%；高表达组生存率低于低表达组患者（χ2=8.544，P=0.003），见图3。单因素分析结果显示，肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、淋巴脉管浸润、神经侵犯、TNM分期和血浆外泌体miR-590-3p表达水平与OS有关（均P＜0.05）；多因素Cox回归模型分析显示，淋巴结转移、神经侵犯、TNM分期Ⅲ期和血浆外泌体miR-590-3p高表达是影响OS的独立危险因素（均P＜0.05），见表2。

图3 CRC患者血浆外泌体miR-590-3p表达水平与OS的关系Fig.3 Relationship between plasma exosomal miR-590-3p expression level and OS in CRC patients

表2 影响CRC患者OS相关风险因素的单因素和多因素分析Tab.2 Univariable and multivariable analyses of risk factors affecting OS in CRC patients

3 讨论

外泌体是一种直径为50～150 nm的微小囊泡，几乎所有类型的细胞包括肿瘤细胞都可以分泌外泌体，其中外泌体在肿瘤发展过程中发挥促进肿瘤生长和血管生成作用，可能是理想的诊断和预后评估标志物，而外泌体介导的治疗也被认为是肿瘤综合治疗的潜在策略［4］。外泌体在CRC中同样显示出以上优势［10］，其传递的miRNA已被证实在CRC的发生、发展、侵袭和转移中扮演着重要角色［5］。此外，结合外泌体包裹的miRNA可以在患者血浆中保持稳定，因此其可能作为一种非侵入性、便捷及敏感的标志物而用于协助CRC的早期诊断和预后评估［11］。既往研究显示，循环中裸露的miRNAs可被内源产生的RNase迅速降解，而外泌体的包裹可保护miRNAs免受RNase降解［12］。因此，相较于循环中的总miRNA，检测血浆外泌体中的miRNA更为准确。当前，恶性肿瘤患者循环血浆外泌体miRNA检测已被证实是一种简单且可靠的早期诊断和预后评估手段［5，13］。如ZHENG等［14］研究发现miR-590-5p在胃癌患者血浆外泌体中呈低表达，且其低表达与患者总生存率降低显著相关，可作为早期诊断标志物及预后评估的独立预测因子。WU等［15］研究显示，miR-1290在肺腺癌患者血清外泌体中的表达较健康对照组显著上调，miR-1290高表达还与肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移及远处转移有关，生存分析也证实血清外泌体miR-1290高表达患者的无进展生存期明显短于低表达患者。在CRC中，多个血浆外泌体miRNAs也已被证实可用于早期辅助诊断和预后评估，如循环血浆外泌体miR-27a和miR-130a在CRC诊断中显示了良好的特异度和灵敏度［16］；血清外泌体miR-548c-5p下调预示患者预后不良［17］；而高水平的血浆外泌体miR-6803-5p是影响患者无进展生存期和OS的独立危险因素［18］。本研究通过评估CRC患者血浆外泌体中miR-590-3p的表达水平及其与患者临床病理特征及预后的关系，证实了miR-590-3p在CRC患者血浆外泌体中呈高表达，且其高表达与多种不良临床病理因素及OS缩短相关；在调整其他混杂因素后，循环血浆外泌体miR-590-3p高表达仍是影响CRC患者预后的独立因危险因素。上述研究结果表明，血浆外泌体miR-590-3p可能是CRC预后评估的潜在标志物。

血浆外泌体miRNAs在评估CRC治疗疗效中也显示出了潜在的预测价值。LIU等［19］报道，在接受FOLFOX方案化疗的Ⅲ期CRC患者中，与血浆外泌体miR-4772-3p高表达组相比，低表达组中90%的患者出现肿瘤复发，显示了外泌体miRNA对辅助化疗反应的潜在预测价值。JIN等［20］也发现CRC患者血清外泌体miRNAs（包括miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p和miR-96-5p）在评估传统化疗敏感性中展现出良好的效能，其中敏感度为78.0%，特异度为88.9%。而本研究结果也提示血浆外泌体miR-590-3p高表达的CRC患者可能具有更高的肿瘤复发转移风险及更差的预后，因此在治疗过程中通过检测miR-590-3p也可能有助于预测治疗效果并对预后进行分层，从而为患者制定个体化的治疗方案，最终改善临床结局。

综上所述，miR-590-3p在CRC患者血浆外泌体中高表达且预示肿瘤恶性进展和不良预后，miR-590-3p具有成为CRC预后评估生物标志物的潜力。但本研究纳入样本量仍较少，且未囊括所有分期，因此血浆外泌体miR-590-3p在CRC中的作用以及通过调控下游哪些靶基因发挥作用仍需进一步探索。