芋螺多肽AuIB对小鼠骨癌痛的影响及其作用机制

陈海韶 刘震 李俊达 宁星 赵璐 李华道 潘灵辉

癌痛是临床晚期癌症患者最常见的症状之一，根据WHO最新公布的数据显示，目前全球每年新增的癌症患者中有51%～62%的患者伴随不同程度的疼痛，其中60%为中重度疼痛［1］。研究显示，约有40%的癌痛患者得不到有效治疗和控制，其中高达75%～95%的晚期癌症患者承受剧烈疼痛，且大部分癌性疼痛患者未得到充分治疗，疼痛完全缓解率不足10%［2-3］。因此，缓解癌症患者疼痛是临床医师亟需解决的一大难题。芋螺多肽AuIB从菲律宾食肉圆锥螺毒液中分离出来，含15个氨基酸残基，能选择性抑制α3β4烟碱乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）［4］。研究显示，烟碱乙酰胆碱受体的多个不同亚型在体外培养的背根神经节中表达并具有药理活性，其中α3β4的烟碱乙酰胆碱受体（包括α3β4亚型）主要在伤害性背根神经节中表达，表明该亚型可能参与伤害性和炎症性神经元信号传导［5］。有研究报道尼古丁通过与nAChRs结合导致下游激活并促进肿瘤生长的相关蛋白，其中包括PI3K/AKT信号通路［6-7］。然而，芋螺多肽AuIB在骨癌痛中能否起到镇痛作用尚不清楚。本研究通过建立骨癌痛小鼠模型，探讨芋螺多肽AuIB在骨癌痛中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

芋螺多肽AuIB购自MCE（Med Chem Express）公司（货号：HY-P1269）。PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT和磷酸化 AKT（p-AKT）均购自 Cell Signaling Technology公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。Von Frey纤维丝痛阈测试包购自美国Stoelting公司。

1.2 肿瘤细胞培养

小鼠来源的肺腺癌细胞Lewis购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。将Lewis细胞接种至含有10%胎牛血清的DMEM培养基，并置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 骨癌痛模型的建立

骨癌痛模型建立参考文献［8］，将小鼠麻醉后，取仰卧位固定于操作台上，腹部朝上，左侧后肢剪毛，用75%乙醇消毒股骨及胫骨处皮肤；在膝关节处沿着股直肌肌腱方向切一长0.5～1.0 cm的皮肤切口，小心暴露髌骨，先用一次性无菌1 mL注射器针头在髌骨沿股骨长轴方向穿刺打孔，然后换上10 μL微量注射器进入股骨骨髓腔，缓慢注入10 μL Lewis小鼠肺癌细胞（3.0×105个）至股骨；注射完毕后用骨蜡封住针孔；然后依次用75%酒精、双氧水、碘伏严格消毒并缝合皮肤；待小鼠苏醒后放回笼中。SHAM组小鼠于左侧股骨骨髓腔内注射生理盐水10 μL。

1.4 实验分组

36只SPF级健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重（25±2）g，购于广西医科大学实验动物中心（动物合格证号为SCXK桂2020-0003）。采用随机数字法，将其分为6组（n=6）：假手术组（SHAM组）、骨癌痛组（BCP组）、生理盐水对照组（NS组）、低剂量AuIB给药组（AuIB1组）、中剂量AuIB给药组（AuIB2组）和高剂量AuIB给药组（AuIB3组）。SHAM组行假手术，BCP组股骨远端注射3.0×105个Lewis细胞构建骨癌痛模型，NS组、AuIB1组、AuIB2组和AuIB3组在股骨远端接种肿瘤细胞后，每天分别腹腔注射100 μL生理盐水、AuIB 0.6 mg/kg、AuIB 1.2 mg/kg和AuIB 2.4 mg/kg（根据前期细胞实验确定各组中AuIB的相应浓度，实验中AuIB均溶于生理盐水）。

1.5 X影像检测各组小鼠股骨病理学改变

术后第14天取SHAM组和BCP组小鼠，用4%水合氯醛麻醉后以仰卧位固定，用X光机拍摄每只小鼠股骨，观察股骨病理学改变情况，确认模型构建是否成功。

1.6 组织切片HE染色观察各组小鼠的组织病理学变化情况

术后第14天取SHAM组和BCP组小鼠术侧股骨标本，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，3%硝酸溶液脱钙2周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，石蜡切片（5 μm），行HE染色。光学显微镜下观察组织病理学变化情况。

1.7 机械缩足阈值测定

机械缩足阈值的具体测定方法参照文献［9］。分别于Lewis小鼠肺腺癌细胞接种前1 d以及接种后3 d、5 d、7 d、11 d和14 d时检测机械缩足阈值。将小鼠置于底部为金属网格的透明树脂玻璃笼中30 min以适应环境，釆用递增力度的Von Frey纤维丝（分别为0.007 g、0.02 g、0.04 g、0.16 g、0.4 g、0.6 g、1 g、1.4 g、2 g、4 g）自足底下方垂直刺激小鼠后足底皮肤表面，每次持续6 s。小鼠对刺激出现快速缩足或藤足行为为阳性反应，为阳性反应时则釆用相邻的低一级力度刺激，直至无阳性反应产生。能引起阳性缩足反应所需的最低力度记为缩足阈值。

1.8 Western blot法检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平

取同侧脊髓L4-L5段背根神经节和大脑皮层组织，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂，冰上裂解，离心，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，蛋白定量后加入蛋白上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性。取30～60 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后200 mA转膜60 min，5%脱脂牛奶室温封闭60 min；加入p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT抗体（稀释比均为1∶1 000），4℃冰箱孵育过夜，TBST洗涤3次；然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温下孵育1 h，TBST洗涤3次。采用电化学发光（ECL）法显影，Image Lab测量条带灰度值，以磷酸化蛋白与总蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠骨癌痛模型的鉴定

X影像显示，术后14 d时，SHAM组骨密度均匀，骨皮质连续，见图1A；而BCP组可见明显的骨结构破坏和损伤，骨密度不均匀，骨皮质有明显缺损，组织周围出现明显肿胀，见图1B。显微镜下可见SHAM组骨膜完整且骨质结构紧密，骨小梁致密且宽，骨细胞清晰可见，且可见新生骨组织，见图1C；而BCP组骨膜缺损且骨质明显破坏，骨小梁排列紊乱，伴随肿瘤细胞在骨髓腔内浸润，见图1D。上述结果说明骨癌痛模型建模成功。

图1 SHAM组和BCP组小鼠的X线影像和HE染色结果Fig.1 The X-ray images and HE staining in SHAM group and BCP group

2.2 芋螺多肽AuIB对骨癌痛小鼠机械痛行为的影响

各组小鼠术前1 d、术后3 d、术后5 d的机械缩足阈值比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；术后7d，与SHAM组相比，BCP组机械缩足阈值明显降低（P＜0.05），说明此时小鼠出现机械痛敏；与相同时间点的BCP组相比，AuIB1组在术后14 d出现机械缩足阈值明显升高（P＜0.05），AuIB2组在术后11 d出现机械缩足阈值明显升高（P＜0.05），AuIB3组在术后7 d出现机械缩足阈值明显升高（P＜0.05），见表1。说明AuIB可改善骨癌痛小鼠机械痛行为且呈浓度依赖性和时间依赖性。

表1 各组小鼠的机械缩足阈值比较［g，（±s）］Tab.1 Comparison of the mechanical paw withdrawal threshold in different groups of mice［g,(±s)］

表1 各组小鼠的机械缩足阈值比较［g，（±s）］Tab.1 Comparison of the mechanical paw withdrawal threshold in different groups of mice［g,(±s)］

#P＜0.05,vs SHAM group at the same time point;*P＜0.05,vs BCP group at the same time point

Group SHAM BCP NS AuIB1 AuIB2 AuIB3 n 6 6 6 6 6 6 F P Preoperative 1 d 1.33±0.16 1.30±0.39 1.37±0.37 1.27±0.21 1.33±0.52 1.37±0.37 0.072 0.996 Postoperative 3 d 0.63±0.20 0.53±0.10 0.60±0.22 0.57±0.23 0.67±0.16 0.63±0.29 0.327 0.893 Postoperative 5 d 0.70±0.24 0.63±0.20 0.50±0.11 0.53±0.28 0.57±0.08 0.60±0.22 0.783 0.570 Postoperative 7 d 0.93±0.30 0.35±0.22#0.39±0.20#0.50±0.32#0.53±0.28#0.77±0.27*4.334 0.004 Postoperative 11 d 1.13±0.33 0.26±0.16#0.27±0.23#0.43±0.23#0.60±0.22#*0.80±0.22#*13.488 0.001 Postoperative 14 d 1.20±0.22 0.16±0.13#0.16±0.14#0.60±0.22#*0.77±0.27#*0.93±0.30#*21.660 0.001

2.3 芋螺多肽AuIB对骨癌痛小鼠背根神经节和大脑皮层中PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响

在背根神经节，与SHAM组相比，BCP组、NS组和AuIB3组中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均显著增加（均P＜0.05）；与BCP组相比，AuIB3组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均降低（均P＜0.05），见图2A～C。相同的结果可以在大脑皮层中观察到，见图2D～F。

图2 芋螺多肽AuIB对骨癌痛小鼠背根神经节和大脑皮层中PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响Fig.2 Effects of α-Conotoxin AuIB on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins in dorsal root ganglia and cerebral cortex of mice with bone cancer pain

3 讨论

癌痛是肿瘤患者后期最常见的并发症，导致骨癌痛的机制较复杂，目前主要认为癌症诱导的骨痛是一种混合机制的疼痛状态表现出的神经性疼痛和炎症性疼痛，是对周围组织和神经有特殊改变以及对脊髓水平独特的神经化学变化，但与神经性疼痛和炎症性疼痛不同的是，骨癌痛的特点是突发性和高强度性［10-12］。因此，骨癌痛是一种复杂的综合征，不但涉及炎症和神经病变，更有缺血性和肿物压迫特异性机制。短暂的高爆发性疼痛也是目前临床上常面临的问题，主要依靠吗啡止痛，但该法止痛并不充分［13］。

海洋药物由于独特的结构及特异高效的生物活性而成为当今的研究热点之一，目前越来越受国内外制药研究者的关注［14］。如，来源于加勒比海荔枝海绵的阿糖胞苷，由于能抑制细胞DNA合成，已成为临床上急性粒细胞白血病标准的治疗药物［15］。从河豚提取的替曲朵辛能选择性阻滞电压门控钠通道而达到镇痛作用，目前已进入Ⅲ期临床试验［16］。但目前关于芋螺多肽的研究仍不多，芋螺多肽AuIB对癌痛是否具有镇痛作用尚不清楚。本研究通过构建骨癌痛小鼠模型探讨芋螺多肽的镇痛作用，结果发现在建模第7天，小鼠出现明显的跛行姿态；在建模第14天，X影像提示骨质明显破坏，病理学提示癌细胞浸润，表明骨癌痛小鼠模型构建成功。进一步在小鼠模型中腹腔注射芋螺多肽AuIB，发现芋螺多肽AuIB能改善小鼠的机械痛行为，并且随着药物浓度的升高，可见小鼠缩足阈值升高的转折点提前，AuIB1组在术后14 d才升高，而AuIB3组在术后7 d已出现升高，说明AuIB可改善骨癌痛小鼠机械痛行为且呈浓度依赖性。

PI3K/AKT信号通路是联系细胞内外信号传递与细胞应答效应的桥梁之一，广泛存在于机体多种细胞中，且参与细胞代谢、增殖、分化、调亡等多种生理过程［17］。越来越多的研究显示PI3K/AKT信号通路在调节疼痛方面发挥重要作用。如SONG等［18］研究显示，柚皮素可能通过下调PI3K信号通路减轻大鼠骨癌痛。李洪波等［19］也报道背根神经节IL-17可能通过激活P13K/AKT信号通路参与大鼠骨癌痛的维持。背根神经节是痛感传入的初级神经元，炎症会导致p-AKT在背根神经节中表达上调，从而引起痛觉过敏［20］。本研究采用不同剂量AuIB注射，发现均能缓解小鼠的机械痛行为，同时在蛋白水平上通过Western blot法检测背根神经节和大脑皮层中PI3K/AKT通路相关蛋白的表达，结果发现注射AuIB后小鼠背根神经节和大脑皮层中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均降低，提示AuIB可能通过下调PI3K/AKT信号通路参与骨癌痛的调节。

综上所述，芋螺多肽AuIB可以减轻骨癌痛小鼠的机械痛阈，且可能是通过调节PI3K-AKT信号通路实现。但是AuIB是通过其既定功能阻断nAChR还是通过其他未知靶点产生作用仍不清楚，未来可以在使用nAChRs激动剂的情况下进一步验证。