结肠癌来源外泌体通过HMGB1诱导中性粒细胞活化促进结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移

周安付 谭琰 张惠晶

随着结肠癌治疗理念以及分子生物学技术的不断发展，结肠癌的治疗已取得长足进步，但总体预后依然不理想［1］。因此，研究者不断探索结肠癌发病机制并挖掘新的治疗靶点，以期改善其预后。既往大量研究显示，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）与肿瘤发生发展密切相关，针对TME的治疗策略也取得很大进展［2］。中性粒细胞作为TME的重要组成部分，也被发现参与了致癌生物学过程的不同阶段，包括肿瘤的启动、增殖及转移扩散［3］。有研究发现，肿瘤来源的外泌体可通过向TME中的免疫细胞发出信号，帮助肿瘤细胞逃避免疫监视，形成转移前的生态位［4］。但肿瘤来源外泌体在中性粒细胞激活中的作用目前尚不明确。高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是在小牛胸腺中发现的一种高度保守的核蛋白，也是多种恶性肿瘤外泌体的重要组成成分之一［5］。既往研究报道HMGB1可以刺激中性粒细胞形成中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）［6］，且 HMGB1 在结肠癌患者血清和癌组织中表达升高［7］。由此推测结肠癌外泌体可能通过HMGB1激活中性粒细胞。本研究旨在探讨结肠癌细胞来源外泌体是否通过HMGB1而在中性粒细胞和结肠癌细胞中发挥作用，以期揭示结肠癌发生发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人结肠癌细胞系SW480和人正常结肠上皮细胞系NCM460购自中国科学院细胞库；shRNA阴性对照（sh-NC）和HMGB1特异性shRNA（sh-HMGB1）购自南京金斯瑞生物科技股份有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂和SYTOX Green Nucleic Acid Stain Protocol购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TransExoTMCell Media Exosome Kit购自北京全式金生物技术有限公司；中性粒细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；HMGB1抗体、TSG101抗体购自美国GeneTex；CD63抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；CD81抗体和GRP94抗体购自英国Abcam公司；GAPDH抗体购自爱必信（上海）生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养及转染

SW480和NCM460细胞用含10% FBS的RPMI-1640培养基培养，细胞培养条件为37℃、5% CO2。每2 d更换一次新鲜培养基，待细胞密度达到80%～90%时，用胰酶液消化细胞，进行传代培养或铺板操作。

将对数生长期的SW480细胞以5×105/mL密度接种于6孔板，培养24 h后，将细胞随机分为3组：SW480组（不进行转染操作）、sh-NC组（转染sh-NC）、sh-HMGB1组（转染sh-HMGB1）。根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行细胞转染，培养48 h后进行后续实验操作。

1.3 外泌体分离和鉴定

收集SW480组、sh-NC组、sh-HMGB1组SW480细胞和NCM460细胞培养上清液，根据TransExoTMCell Media Exosome Kit说明书分离各组细胞培养上清液中的外泌体，分别命名为SW480-exo、sh-NC-exo、sh-HMGB1-exo、NCM460-exo。采用透射电镜观察外泌体形态，纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径，Western blot实验检测外泌体标志性蛋白TSG101、CD63、CD81和细胞标志性蛋白GRP94的表达。

1.4 中性粒细胞的分离及分组

收集2018年8月—2020年8月海南医学院第一附属医院的健康体检者血液样本，血液样本的采集经本院伦理委员会审批通过，所有研究对象均签署知情同意书。中性粒细胞分离：向分离液中缓慢加入血液样本，1 000 r/min离心30 min。吸取白膜中性粒细胞层至新的离心管内，PBS清洗，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液；用含10%FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，用台盼蓝拒染法测定中性粒细胞存活率和纯度，存活率＞95%、纯度＞95%表示中性粒细胞分离成功。分离成功的中性粒细胞分别添加PBS、NCM460-exo、SW480-exo、NCM460-exo、sh-NC-exo和sh-HMGB1-exo，外泌体添加量均为20 μg/mL，依次记为PBS组、NCM460-exo组、SW480-exo组、sh-NC-exo组和sh-HMGB1-exo组。继续培养24 h后，用PBS洗涤2次，加入含MNase（1 U/mL）酶的培养基，在37℃下孵育20 min；加入EDTA终止，离心取上清液，立即使用或置于-80℃条件下保存。

1.5 Sytox green染色检测中性粒细胞NETs形成情况

收集各组中性粒细胞培养上清液，PBS清洗后，用4%多聚甲醛室温固定15 min，加入Sytox green染色液，室温下避光孵育20 min后，弃去染色液。PBS再次清洗后，使用荧光显微镜观察细胞发光情况，用Image J软件分析Sytox green荧光单位。

1.6 Western blot检测HMGB1、TSG101、CD63、CD81和GRP94蛋白的表达水平

收集细胞和外泌体，采用RIPA裂解液裂解。离心收集上清液并测定其蛋白浓度。各组取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳以及转膜操作。5%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，加入HMGB1（1∶1 000）、TSG101（1∶2 000）、CD63（1∶2 000）、CD81（1∶1 000）、GRP94（1∶1 000）和 GAPDH（1∶5 000）抗体稀释液，4 ℃条件下孵育过夜；加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，滴加ECL发光液，凝胶成像系统检测蛋白条带，Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

1.7 CCK-8法检测细胞活力

取对数生长期的SW480细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞。将细胞随机分为PBS+Neutrophils组、SW480-exo+Neutrophils组、sh-NC-exo+Neutrophils组和sh-HMGB1-exo+Neutrophils组，按照分组，添加对应中性粒细胞培养上清液（与新鲜培养基比例为1∶1）。继续培养48 h后，根据CCK-8试剂盒说明书检测各组细胞光密度（OD）值。细胞活力（%）=［（实验组OD值-空白组OD值）/（PBS+Neutrophils组OD值-空白组OD值）］×100%或者是细胞活力（%）=［（实验组OD值-空白组OD值）/（SW480-exo+Neutrophils组OD值-空白组OD值）］×100%。

1.8 克隆形成实验检测细胞增殖情况

将对数生长期的SW480细胞接种于培养皿中，每皿接种300个细胞，细胞分组及处理同CCK-8法。各组细胞连续培养2周，弃去培养液，PBS清洗3次。4%多聚甲醛室温固定细胞15 min。移除固定液，加入吉姆萨染色液染色10 min后，流水冲洗，空气干燥。肉眼直接计数克隆数。

1.9 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况

将对数生长期SW480细胞接种于Transwell上室，每孔5×104个细胞，细胞分组及处理同CCK-8法；Transwell下室则加入600 μL含20%FBS的RPMI-1640培养基。细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛室温固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，在显微镜下观察细胞迁移情况。侵袭实验时，除所用Transwell小室预先用Matrigel包被外，其余操作步骤与迁移实验相同。

1.10 统计学方法

使用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示。两组间数据的比较采用独立样本t检验，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌细胞来源外泌体的鉴定

用透射电镜观察结肠癌细胞来源外泌体的形态，结果显示，SW480-exo呈圆形囊泡结构，见图1A；Western blot检测结果显示，SW480-exo中TSG101、CD63、CD81蛋白呈阳性表达，GRP94蛋白不表达；而SW480细胞中TSG101、CD63、CD81蛋白表达不明显，GRP94蛋白明显表达，见图1B；纳米颗粒跟踪分析仪检测结果显示，SW480-exo平均直径为100 nm，见图1C。以上实验结果表明结肠癌细胞来源外泌体分离成功。

图1 结肠癌细胞来源外泌体的鉴定Fig.1 Identification of exosomes from colon cancer cells

2.2 结肠癌外泌体及中性粒细胞中HMGB1的表达水平

Western blot检测结肠癌细胞SW480和正常结肠上皮细胞NCM460外泌体中HMGB1蛋白含量，结果显示，SW480-exo中HMGB1蛋白含量明显高于NCM460-exo（P=0.003），见图2A。PBS和SW480-exo分别处理中性粒细胞后，SW480-exo组中性粒细胞中HMGB1蛋白的表达水平较PBS组明显升高（P=0.001），见图2B。

图2 Western blot检测结肠癌外泌体和中性粒细胞中HMGB1蛋白的表达Fig.2 Expression of HMGB1 protein in colon cancer exosomes and neutrophils detected by Western blot

2.3 SW480-exo对中性粒细胞NETs形成的影响

PBS、NCM460-exo或SW480-exo分别处理中性粒细胞后，用Sytox green染色检测中性粒细胞NETs形成情况，结果显示，与PBS组相比，NCM460-exo组中性粒细胞的Sytox green荧光单位无明显变化（P=0.643），但SW480-exo组中性粒细胞Sytox green荧光单位明显升高（P=0.006），见图3。

图3 Sytox green染色检测中性粒细胞NETs形成（×400）Fig.3 Sytox Green staining for the formation of neutrophil NETs(×400)

2.4 经SW480-exo处理的中性粒细胞对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

CCK-8、克隆形成实验和Transwell实验检测结果显示，与PBS+Neutrophils组相比，SW480-exo+Neutrophils组SW480细胞活力（P=0.002）、克隆形成数（P=0.003）、迁移细胞数（P=0.004）和侵袭细胞数（P=0.006）均明显升高，见图4。

图4 经SW480-exo处理的中性粒细胞对结肠癌细胞的影响Fig.4 Effect of neutrophils treated with SW480-exo on colon cancer cells

2.5 sh-HMGB1-exo对中性粒细胞NETs形成的影响

Western blot检测结果显示，sh-NC和sh-HMGB1转染SW480细胞后，sh-HMGB1组细胞中HMGB1蛋白表达较sh-NC组明显降低（P=0.003），但SW480组与sh-NC组比较差异无统计学意义（P=0.728），见图5A。表明敲低HMGB1的结肠癌细胞模型构建成功。

SW480-exo、sh-NC-exo和sh-HMGB1-exo处理中性粒细胞后，sh-HMGB1-exo组细胞中HMGB1蛋白表达（P=0.002）和Sytox green荧光单位（P=0.004）均较sh-NC-exo组明显降低，但sh-NC-exo组与SW480-exo组比较差异无统计学意义（均P＞0.05），见图5B～C。

图5 sh-HMGB1-exo对中性粒细胞NETs形成的影响Fig.5 Effect of sh-HMGB1-exo on the formation of neutrophil NETs

2.6 经sh-HMGB1-exo处理的中性粒细胞对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

CCK-8法、克隆形成实验和Transwell实验检测结果显示，与sh-NC-exo+Neutrophils组相比，sh-HMGB1-exo+Neutrophils组SW480细胞活力（P=0.008）、克隆形成数（P=0.010）、迁移细胞数（P=0.007）和侵袭细胞数（P=0.005）均明显降低，但SW480-exo+Neutrophils组无明显变化（均P＞0.05），见图6。

图6 经sh-HMGB1-exo处理的中性粒细胞对结肠癌细胞的影响Fig.6 Effect of sh-HMGB1-exo-treated neutrophils on colon cancer cells

3 讨论

中性粒细胞是人体循环中含量最丰富的白细胞，在炎症和宿主防御微生物感染方面起着关键作用［8］。中性粒细胞通常被认为对肿瘤细胞有防御反应，但最近的证据表明肿瘤调节中性粒细胞功能以支持肿瘤生长和发展，且主要参与促进肿瘤发生、转移、血管生成和免疫抑制等［9］。有研究显示，中性粒细胞可能通过趋化、吞噬、脱颗粒和形成NETs发挥其功能［10］。NETs是一种网状结构，包含由中性粒细胞在一定刺激下排出的解聚DNA细丝和颗粒内容物，可诱导一种不同于凋亡和坏死的新型细胞死亡［11］。NETs还含有丰富的促炎分子，且与各种无菌炎症条件有关［12］。研究表明，中性粒细胞可通过NETs捕获循环中的肿瘤细胞而促进细胞向远处转移，从而导致肿瘤细胞扩散［13］。动物实验表明，结肠癌肝转移模型中的中性粒细胞水平升高与NETs形成及肿瘤转移密切相关［14］。然而，NETs在结肠癌微环境中的作用及机制并不清楚。近年来研究显示，结肠癌细胞来源外泌体作为细胞间通讯的信使，也是肿瘤发生的介质。而靶向抑制外泌体可能是结直肠癌潜在的有效治疗方法［15］。此外，还有证据显示，结肠癌来源外泌体通过将突变的KRAS转移到中性粒细胞，从而诱导中性粒细胞募集和NETs形成，最终导致疾病恶化［16］。本研究亦发现，结肠癌来源外泌体SW480-exo处理中性粒细胞可诱导其NETs形成，进一步将经SW480-exo处理的中性粒细胞培养上清液添加至结肠癌细胞中，发现结肠癌细胞活力、细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数均升高，提示结肠癌来源外泌体可能通过诱导中性粒细胞NETs的形成，进一步促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。

HMGB1作为肿瘤外泌体的成分之一，主要通过调节免疫反应参与癌症进展。如，LI等［17］报道食管鳞状细胞癌来源的外泌体通过HMGB1诱导巨噬细胞M2表型转换，从而促进疾病进展。肝细胞癌细胞来源外泌体也能通过HMGB1激活B细胞并促进TIM-1+Breg细胞扩增，从而促进肝细胞癌免疫逃避和疾病进展［18］。目前，已有证据显示，HMGB1可能是NETs的重要组成部分。ZHA等［19］在胶质瘤细胞中发现HMGB1能修饰NETs的网状结构，同时与胶质瘤细胞上的相关因子相互作用导致核因子NF-κB激活，从而促进细胞增殖、迁移和侵袭。还有研究发现，乳腺癌患者血清HMGB1水平与中性粒细胞数量呈正相关，其中低氧原发肿瘤可导致肿瘤细胞分泌HMGB1，诱导中性粒细胞CD62Ldim表型极化，从而促进肿瘤转移［20］。本研究发现，结肠癌细胞外泌体中HMGB1含量明显高于正常结肠上皮细胞，且结肠癌来源外泌体SW480-exo可诱导中性粒细胞表达HMGB1和NETs形成，但用敲低HMGB1的结肠癌细胞外泌体sh-HMGB1-exo处理中性粒细胞发现HMGB1表达下调且NETs形成减少；进一步将sh-HMGB1-exo处理的中性粒细胞培养上清液加入结肠癌细胞中，发现结肠癌细胞活力、增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数均降低，与上述文献［18-20］报道一致。说明结肠癌来源外泌体可能通过HMGB1诱导中性粒细胞NETs的形成，进而促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，结肠癌来源外泌体可能通过将HMGB1传递至中性粒细胞中并诱导NETs形成，从而促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，HMGB1可能是潜在的治疗靶点。本研究结果有助于进一步阐明结肠癌发病机制，也为开发新的治疗靶点提供了的思路。