五种果汁的酚类组成及其抗氧化、抗肿瘤细胞增殖活性研究

卢 薇，费建军，沈晓梅，王金梅,

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉 430000；2.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳 550005；3.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

癌症是工业国家死亡率最高的疾病之一，全球每年约有760万人死于癌症[1]。活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是诱发癌症的主因之一[2]。ROS是细胞代谢的常规产物，低、中水平的ROS在机体细胞缺氧应答中发挥重要的生理作用[3]。然而，当ROS过量生成且机体内抗氧化剂的含量不足以将其清除时，氧化应激作用会导致机体损伤，影响细胞脂质、蛋白和DNA的正常功能，并导致癌症等疾病的发生[3]。临床研究表明，增加水果的摄入量可降低罹患癌症的风险[4]。水果中多酚、维生素等抗氧化活性成分可通过改善机体氧化应激状态、调节相关基因表达、调节细胞凋亡及免疫系统等方式维系ROS的动态平衡，保护机体，有利于癌症的防治[2]。

浆果类水果如蓝莓是公认的多酚和维生素C含量较高、抗氧化活性较好的水果[5-6]；柑橘类水果的果皮中富含多酚类物质，果肉中多酚含量相对较少[7]；刺梨和沙棘是我国西北部地区的特色水果，已被证实具有良好的体外抗氧化效果[8-9]，但对其活性成分及功效评价的研究较少，精深加工产品不多。水果贮藏期短、附加值低，部分水果如刺梨直接食用时具有较强的涩感[10]，故工业生产中常以果汁形式进行销售以提高水果的经济效益。目前，学界多以水果丙酮提取物[11]、醇提物[12]对全果中多酚进行成分鉴定，鲜见果汁中多酚的功效评价，而水果榨汁过程中的机械作用和过滤过程可能会造成果汁和全果中多酚和VC等活性成分分布及含量的差异[13]。此外，大量研究仍集中于多酚的体外抗氧化性，并未涉及多酚的吸收代谢情况及生物利用率，从细胞层面上分析果汁中多酚的抗氧化能力和抗增殖活性具有更高的生物相关性[14]。

本文研究对比了5种果汁（刺梨、柠檬、蓝莓、柑橘和沙棘）中VC和总酚的含量，对多酚组成进行定性和定量分析，采用羟自由基清除法（PSC）、氧化自由基吸收能力法（ORAC）等化学方法和抗细胞氧化活性（CAA）、抗增殖活性、细胞毒性分析等细胞水平分析方法评价5种果汁的抗氧化和抗肿瘤细胞增殖活性，为水果精深加工提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺梨原汁 贵州恒力源天然生物科技有限公司；沙棘原汁 内蒙古淳点实业有限公司；蓝莓原汁、柑橘原汁和柠檬原汁 实验室自制；2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、2,2’-偶氮双（2-氨基丙烷）盐酸盐（ABAP）、福林酚试剂、没食子酸、芦丁、儿茶素、阿魏酸、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFHDA）、荧光素、维生素C、维生素E、槲皮素 美国Sigma公司；HepG2细胞 实验动物中心（中国，广东，中山大学）；培养基（WME）、磷酸盐缓冲液（PBS）美国GIBCO公司。

UVA2300型紫外分光光度计 上海天美公司；RV 10型旋转蒸发仪 德国IKA公司；1525-2487UV型高效液相色谱仪 美国Waters公司；Synergy Neo2型多功能酶标仪 美国博腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水果原汁的制备 将蓝莓、柑橘和柠檬鲜果洗净并沥干后分别用榨汁机打浆，将浆液过200目筛，取滤液制得水果原汁，-4 ℃冷藏备用。

1.2.2 果汁活性物质提取 参考王怀玲[14]的方法并做适当修改。称取2 mL果汁样品，加入80%丙酮40 mL，搅拌混匀，冰浴超声10 min，4000 r/min离心10 min，收集上清提取液。滤渣重复提取3次。收集全部上清提取液后45 ℃旋转蒸发至近干。用超纯水定容至10 mL。提取液贮存于-20 ℃备用。

1.2.3 维生素C含量的测定 参考GB 5009.86-2016食品中抗坏血酸的测定[15]，以高效液相色谱法测定果汁中VC的含量。

1.2.4 总多酚含量的测定 采用福林酚试剂法测定样品总酚含量[13]。取适当稀释的提取物和标准品各0.1 mL与0.4 mL超纯水混合，加入0.1 mL福林酚试剂氧化6 min，再加入1 mL碳酸钠溶液（7%）和0.8 mL的超纯水，静置90 min，使用分光光度计在760 nm处测定混合物的吸光度。以没食子酸为标品，测定结果以没食子酸当量表示（g GAE/L）表示。

1.2.5 多酚组分分析 采用高效液相色谱法对果汁中酚类物质进行分析测定，参考赵谋明等[13]的方法并做适当修改。采用C18色谱柱，柱温30 °C，检测波长280 nm，流动相（A，0.1%三氟乙酸水溶液；B，乙腈）以1.0 mL/min的速度进行梯度洗脱，方法如下：0～5 min，90% A；5～20 min，90%～75% A；20～25 min，75%～65% A；25～31 min，65%～42% A；31～34 min，42%～40% A；34～40 min，40%～10% A；40～50 min，10%～90% A；50～60 min，90% A。

1.2.6 过氧化氢自由基清除能力（PSC）分析 通过测定样品的过氧化氢自由基清除能力来分析样品总化学抗氧化活性，参考王怀玲[14]的方法并做适当修改。75 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）稀释植物化学提取物。将0.1 mL稀释样品与0.1 mL DCFH-DA（13.26 mmol/L）和 0.05 mL ABAP（40 mmol/L）混合。反应在37 ℃下进行，多功能酶标仪对样品荧光值监测，计算半有效抑制浓度（EC50）。以VC为标品，测定结果以VC当量表示（μmol VCE/mL）。

1.2.7 氧自由基吸收能力（ORAC）分析 通过测定样品的氧自由基吸收能力可用于分析样品总化学抗氧化活性，参考王怀玲[14]的方法并做适当修改。75 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）稀释植物化学提取物。于96孔板中加入20 μL样品和空白对照（缓冲液）于37 ℃孵育10 min；加入200 μL荧光素于37 ℃孵育10 min；除了空白孔（空白加入缓冲液）外，每孔加入20 μL的ABAP溶液。反应在37 ℃下进行，多功能酶标仪对样品荧光值监测。以维生素E为标品，测定结果以维生素E当量表示（μmol TE/mL）。

1.2.8 抗细胞氧化活性（CAA）分析 评价样品在细胞水平的抗氧化活性，参考王怀玲[14]的方法并做适当修改。主要步骤包括：a.将培养适宜的HepG2细胞以6×104cells/孔的浓度接种于96孔黑色孔板上，于培养箱中孵育24 h；b.弃去培养基，用PBS洗涤孔板；c.每孔中加入 100 μL 含 DCFH-DA（50 μmol/L）的样品，培养1 h；d.弃去样品，对细胞进行不同处理：用 PBS冲洗微孔，加入 100 μL ABAP；无 PBS冲洗，直接将100 μL ABAP加入到未经冲洗的微孔中；e.使用多功能酶标仪在485 nm激发和538 nm发射波长下每隔5 min测定荧光值，实验温度37 ℃，持续测量1 h。每块测定板包括三个对照孔和空白孔：对照孔是经DCFH-DA和ABAP处理的细胞；空白孔中是经DCFH-DA和无ABAP处理的细胞。以槲皮素为标品，测定结果以槲皮素当量表示（μmol QE/100 mL）。

1.2.9 抗肿瘤细胞增殖活性和细胞毒性分析 对样品的抗肿瘤细胞增殖活性和细胞毒性进行分析比较，参考王怀玲[14]的方法并做适当修改。细胞培养方法与CAA法相似。主要步骤包括：a.将培养适宜的HepG2细胞以1.5×104cells/孔的浓度接种于96孔白色孔板上进行抗增殖活性分析，细胞毒性分析采用的细胞浓度则为2.5×104cells/孔；b.两者均于培养箱中分别孵育4和24 h；c.弃去培养基，用PBS洗涤孔板；d.用培养基对样品进行梯度稀释，每孔加入100 μL样品，分别培养72和24 h；e.采用亚甲基蓝染色法测定细胞存活量。样品的抗肿瘤细胞增殖活性和细胞毒性分析分别以 EC50（mg/mL）和 CC50（mg/mL）表示。

1.3 数据处理

实验数据为三次测定平均值，结果以“平均值（mean）±标准偏差（SD）”表示。组间的显著性差异和相关性分析采用SPSS 19.0软件的ANOVA分析方法，方差分析之后的多重比较采用Duncan’s法，P＜0.05表示样本间具有显著性差异，P＜0.01表示样品间差异极显著，并对样品进行聚类分析。

2 结果分析

2.1 五种果汁的维生素C含量和酚类组成

果汁较强的抗氧化性及其抗衰老、预防癌症的功效主要归因于果汁中所含的抗氧化物质如酚类化合物、维生素C、维生素E、类胡萝卜素等[16]。五种果汁中VC和总酚含量见图1。由图可知，刺梨汁的VC含量最高，为14.13 g/L；沙棘汁的VC含量次之，为1.92 g/L；柠檬汁、蓝莓汁和柑橘汁的VC含量远低于刺梨汁和沙棘汁，且三者间无显著性差异（P＞0.05）。沙棘和刺梨均富含VC，不同品种沙棘鲜果中VC含量为140～3000 mg/100 g[17]，是常见果蔬的五至数百倍[18]；不同品种刺梨鲜果的VC含量高达1300～3500 mg/100 g[19]。岳珍珍[20]等报道野刺梨汁中VC总量约为17.50 g/L，与本文测定值较为接近。张娟等[21]报道新鲜沙棘汁中VC总量约为3.10 g/L，高于本文测定值，这可能是制备工艺的差异和贮藏过程造成的VC损耗。

图1 五种果汁的维生素C和总酚含量Fig.1 Content of vitamin C and total phenolic of five juices

五种果汁的总酚与VC含量呈相似的趋势，其中，刺梨汁和沙棘汁的总酚含量最高，分别为13.06±0.48和12.53±1.17 g GAE/ L，且二者间无显著性差异（P＞0.05）；蓝莓汁的总酚含量次之，为 1.82 g GAE/L；柠檬汁和柑橘汁的总酚含量最低，分别为0.33和0.48 g GAE/ L。大量研究表明，蓝莓果实的总酚含量远高于柑橘、柠檬等常见果蔬[4]。王怀玲[14]测定了14种蓝莓果实的总酚为212.7～460.4 mg GAE/100 g FW，Zeng等[22]报道了不同成熟期刺梨果实的总酚含量在129.26～154.81 mg GAE/g DW之间，考虑到刺梨的含水量，折算出刺梨果实的总酚含量约为蓝莓果实总酚含量的10～20倍，与本文中两种果汁的总酚含量之比基本一致。刺梨果实中酚类化合物和VC含量较为接近[10]，与本文结果类似。岳珍珍[20]报道野刺梨汁中总酚含量为9.34 g/L，安雪菲等[8]报道无子刺梨汁中总酚含量约为32.81 g/kg。Tkacz等[23]报道沙棘汁中总酚含量为4.60 g/L。水果亚种和成熟度对水果中活性成分含量的影响极大[22]，且部分水果的果肉和果皮中的活性成分含量也有显著差异[7]。因此，原料和工艺均会导致果汁中VC和总酚等活性成分含量的不同。

对五种果汁的酚类组成和含量进行分析，结果见表1。由表可知，刺梨汁中检出的主要酚类物质为没食子酸（5.48 mg/100 mL）、芦丁（53.61 mg/100 mL）和儿茶素（68.69 mg/100 mL）。多酚类化合物主要包括黄酮类化合物和非黄酮类化合物如酚酸、芪类化合物、单宁等物质。刺梨中多酚主要由黄酮和酚酸组成[10]，Liu等[24]在刺梨果实中鉴定出了芦丁、槲皮苷、山奈酚和木犀草素，Zeng等[22]在刺梨果实中鉴定出了儿茶素、表儿茶素、鞣花素、杨梅酮、奎尼酸、槲皮素。

表1 五种果汁的酚类组成和含量Table 1 Phenolic profiles and content in five juices

沙棘汁中检出的主要酚类物质为没食子酸（6.64 mg/100 mL）、芦丁（16.71 mg/100 mL）、儿茶素（3.33 mg/100 mL）和阿魏酸（1.16 mg/100 mL）。小浆果中一般含有大量植物酚酸类物质。沙棘鲜果中的酚酸类物质主要由羟基苯甲酸和羟基肉桂酸的衍生物组成，如没食子酸，其含量约为7.9～15.9 mg/kg DW，阿魏酸的含量低于10.5 mg/kg DW[19]。芦丁是沙棘鲜果中常见的黄酮苷，其含量约为233～285 mg/kg DW[19]。儿茶素是沙棘鲜果中主要的黄酮类物质，Irena等[25]测定了9种沙棘鲜果中的儿茶素含量为5.4～110.3 mg/kg DW。

蓝莓汁中检出的主要酚类物质为儿茶素（0.19 mg/100 mL）和阿魏酸（0.14 mg/100 mL）。王怀玲[14]测定了14种蓝莓果实的儿茶素和阿魏酸含量分别在0.18～0.34 和 0.03～0.18 mg /100 g FW 之间，并检出了香豆酸、水杨酸、槲皮素和白藜芦醇。

柠檬汁中检出的主要酚类物质为芦丁（2.09 mg/100 mL）和阿魏酸（0.06 mg/100 mL），柑橘汁中仅检出阿魏酸（0.52 mg/100 mL）。柑橘类水果富含橘皮素、柚皮素和多甲氧基黄酮等特征性黄酮类物质，也含有芦丁、槲皮素等水果中常见的多酚类物质，但部分柑橘类品种如Eureka lemon中未检出芦丁[26]。

2.2 五种果汁的化学抗氧化活性

化学法是常见的评价体外总抗氧化活性的方法，其中，PSC法和ORAC法均通过荧光探针检测自由基的含量来评价样品清除氧自由基的能力，具有一定的生物相关性[14]。五种果汁的体外抗氧化性质见图2。由图2可知，五种果汁的PSC抗氧化活性和ORAC抗氧化活性呈现相同的趋势，即沙棘汁、刺梨汁和蓝莓汁的抗氧化活性较高，排序为沙棘汁（66.12 μmol VCE/mL，111.57 μmol TE/mL）＞刺梨汁（38.10 μmol VCE/mL，89.72 μmol TE/mL）＞蓝莓汁（12.60 μmol VCE/mL，39.59 μmol TE/mL）；柠檬汁（0.46 μmol VCE/mL，6.99 μmol TE/mL）和柑橘汁（3.33 μmol VCE/mL，1.83 μmol TE/mL）抗氧化活性较低且二者间的抗氧化活性无显著性差异（P＞0.05）。王怀玲[14]测定了14种蓝莓果实中游离多酚的PSC值（8.59～17.54 μmol VCE/g FW）和 ORAC 值（26.27～67.47 μmol TE/g FW）。Tkacz等[23]报道沙棘汁的ORAC值为74.2 μmol TE/mL，略低于本文中沙棘汁的测定值。由此可知，沙棘汁、刺梨汁和蓝莓汁具有较强的清除氧自由基的能力，体外总抗氧化活性较高，而柠檬汁和柑橘汁的体外总抗氧化活性较低，这可能与不同果汁的VC和多酚组成成分的差异性有关。

图2 五种果汁的PSC抗氧化活性和ORAC抗氧化活性Fig.2 Peroxyl radical scavenging capacity and oxygen free radical absorptive capacity of five juices

2.3 五种果汁的抗细胞氧化活性

除了清除自由基活性外，机体内的抗氧化水平还包括阻断自由基的产生和增加内生抗氧化剂水平等。抗细胞氧化活性可用于测定活性物质在生理条件下的生物利用度及其对抗氧化能力的影响，较化学法更具科学性。CAA法是常见的评估HepG2细胞模型的食品及膳食补充剂的抗氧化剂水平的方法，其通过检测样品在一段时间内的荧光强度变化来定量样品的抗氧化活性[27]。其中PBS冲洗过程可在一定程度上反映活性物质能否顺利通过细胞膜及其与细胞膜结合的紧密程度[28]，判断活性物质是进入胞内与活性氧自由基反应还是在细胞膜上直接与胞外的氧自由基反应[29]。五种果汁经PBS冲洗前后的CAA值见图3。由图3可知，无PBS冲洗时，果汁的CAA值由高至低为：刺梨汁（163.96 mg/QE 100 mL）＞沙棘汁（126.67 mg/QE 100 mL）＞蓝莓汁（63.97 mg/QE 100 mL）＞柑橘汁（8.77 mg/QE 100 mL）＞柠檬汁（1.05 mg/QE 100 mL）。经PBS冲洗后，果汁的细胞抗氧化能力明显下降，其排序由高至低为：沙棘汁（82.68 mg/QE 100 mL）＞刺梨汁（46.33 mg/QE 100 mL）＞蓝莓汁（23.63 mg/QE 100 mL）＞柠檬汁（0.39 mg/QE 100 mL）＞柑橘汁（ND）。根据PBS冲洗前后的结果可知不同果汁的细胞吸收率为沙棘汁（65.27%）＞蓝莓汁（36.95%）＞刺梨汁（28.26%）。柠檬汁和柑橘汁的CAA值过低，说明上述两种果汁的抗细胞氧化活性较低，这可能是由于其VC和多酚含量较低导致的，故此处不讨论其细胞吸收率。

图3 五种果汁的细胞抗氧化活性Fig.3 Cellular antioxidant activity （CAA） of five juices

2.4 五种果汁的抗肿瘤细胞增殖活性和细胞毒性

活性物质抑制肿瘤细胞半数生长时的浓度可反映其抗肿瘤细胞增殖活性的强度，半抑制浓度（EC50）越低，该物质的抗肿瘤细胞增殖活性越高；对细胞造成半数毒性的浓度（CC50）越小，该物质的细胞毒性越大[30]。不同果汁对HepG2肝癌细胞具有不同的抗增殖活性，见表2。刺梨汁（5.50 mg/mL）和沙棘汁（7.67 mg/mL）的抗肿瘤细胞增殖活性最强，蓝莓汁（30.72 mg/mL）和柠檬汁（33.39 mg/mL）次之，柑橘汁（119.80 mg/mL）的抗肿瘤细胞增殖活性最弱。刺梨汁、柑橘汁和蓝莓汁的CC50值均高于150 mg/mL，说明上述三种果汁的毒性很低。有研究表明，蓝莓对HepG2细胞有一定的抗增殖活性[14]，沙棘对HepG2细胞、MCF-7细胞和Caco-2细胞均有抑制增殖的作用[27]。

表2 五种果汁的抗肿瘤细胞增殖活性和细胞毒性（mean±SD, n=3）Table 2 Antiproliferative activities towards tumor cells and cytotoxicities of five juices (mean±SD, n=3)

2.5 聚类相关性分析

果汁中的活性成分与抗氧化活性、抗肿瘤细胞增殖活性之间的相关性分析见图4。PSC值与没食子酸含量（R2=0.957,P＜0.05）和总酚含量（R2=0.920,P＜0.05）均显著相关。类似的，ORAC值与没食子酸含量（R2=0.955,P＜0.05）和总酚含量（R2=0.959,P＜0.01）均密切相关。冲洗前后，果汁的CAA值与没食子酸含量及总酚含量均显著相关，与VC、儿茶素和芦丁的含量也有一定的正相关性。EC50值与各活性成分基本呈负相关，说明活性物质含量与抗肿瘤细胞增殖活性基本呈正相关。由此可见，多酚类组分尤其是没食子酸与果汁的化学抗氧化活性和抗细胞氧化活性具有显著的正相关性，其可进入胞内与活性氧自由基反应达到良好的抗细胞氧化效果，VC、儿茶素和芦丁含量也与抗细胞氧化活性具有一定的正相关性。

图4 果汁中活性物质与抗氧化、抗肿瘤细胞增值活性之间的Pearson相关性分析Fig.4 Pearson correlation coefficients （probability） among phenolics profiling and anti-oxidative and anti-proliferative activities towards tumor cells

本研究通过SPSS 19.0统计分析软件，对五种果汁的主要活性成分（维生素C、阿魏酸、儿茶素、芦丁、没食子酸和总酚）和抗氧化活性（PSC、ORAC、CAA未冲洗、CAA冲洗和EC50）进行聚类分析，并绘制树状图，见图5。结果显示，五种果汁可根据多酚物质种类、含量及抗氧化活性分为2类：a.刺梨汁和沙棘汁；b.柠檬汁、蓝莓汁和柑橘汁。刺梨汁中发挥抗氧化活性的主要物质组成为VC、儿茶素和芦丁，对刺梨汁的化学抗氧化活性和抗细胞氧化活性贡献较大。沙棘汁中发挥抗氧化活性的物质为阿魏酸和没食子酸，对化学抗氧化活性和抗细胞氧化活性均有较大贡献。

图5 五种果汁各项指标的聚类分析热图Fig.5 Cluster analysis heat map of each index of five juices

3 结论

上述结果表明，五种果汁中刺梨汁的VC含量最高，为14.13 g/L；刺梨汁和沙棘汁的总酚含量最高，分别为 13.06±0.48和 12.53±1.17 g GAE/L，且二者间无显著差异（P＞0.05）。刺梨汁和沙棘汁的酚类物质种类多于其他果汁，且二者的酚类物质组成较为接近，但刺梨汁中的芦丁和儿茶素含量高于沙棘汁。整体而言，果汁的抗氧化活性与没食子酸和总酚含量有显著相关性，VC、儿茶素和芦丁含量也与抗细胞氧化活性具有一定的正相关性。其中，沙棘汁的化学抗氧化活性最强；刺梨汁的抗细胞氧化活性最强，但其28.26%的细胞吸收率低于沙棘汁（65.27%）和蓝莓汁（36.95%）；刺梨汁具有最强的抗肿瘤细胞增殖活性和最低的细胞毒性。聚类分析根据多酚物质种类、含量及抗氧化活性将五种果汁分为2类：刺梨汁和沙棘汁；柠檬汁、蓝莓汁和柑橘汁。不同于目前学界常以体外抗氧化活性评估全果的功能性，本文从细胞层面对全果果汁的抗氧化能力和抗增殖活性进行分析，具有更高的生物相关性，可为我国特色水果的精深加工提供一定的理论基础。但本文仍存在以下不足：a.本文主要研究了果汁游离态提取物的性质，其结合态提取物的酚类组成、抗氧化能力和抗增殖活性有待进一步研究；b.本文未对不同品种、不同成熟度全果制备的果汁的相关指标进行测试和分析，而品种和成熟度对水果中酚类组成的影响较大，可进一步影响果汁的抗氧化能力和抗肿瘤细胞增殖活性。