SLC16A1-AS1负调控miR-450b-5p对结直肠癌细胞Caco-2细胞周期、迁移、侵袭和凋亡的影响

斯日古楞 程健泽 赵伟军

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率随着人口老龄化及人们饮食习惯的改变逐年升高[1]。结直肠癌临床表现隐秘，多数患者确诊时已为中晚期，预后较差[2]。研究显示，结直肠癌与多基因表观遗传、转录及翻译等多层次异常变化有关[3]，探讨结直肠癌中异常表达的基因分子及其对该肿瘤发生发展的影响可为其治疗提供分子靶点。长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是两类小分子非编码RNA，且lncRNA可作为竞争性内源性RNA与miRNA靶向结合，调控miRNA靶基因的表达，进而影响细胞的增殖、分化和凋亡等生命活动，与肿瘤的发生发展密切相关[4,5]。溶质载体家族16成员1的反义RNA 1(SLC16A1-AS1)是一种lncRNA，参与多种肿瘤的发展进程。例如，SLC16A1-AS1在肝细胞癌组织和细胞中的表达明显下调，过表达SLC16A1-AS1可靶向调控的miR-301b-3p/CHD5轴抑制肝细胞癌细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化过程，促进细胞凋亡，增强细胞放射敏感性[6]。但目前，SLC16A1-AS1能否影响结直肠癌的发生发展还未知。LncBase v.2生物信息学软件预测显示，SLC16A1-AS1可能靶向调控miR-450b-5p。研究显示，miR-450b-5p在结直肠组织中呈高表达，其高表达与肿瘤分化不良、TNM分期晚和预后不良呈正相关，过表达miR-450b-5p可靶向抑制SFRP2和SIAH1的表达并激活Wnt/β-Catenin信号传导促进结直肠癌细胞增殖及肿瘤生长，同时抑制细胞凋亡[7]。本研究探讨SLC16A1-AS1对Caco-2细胞的细胞周期、迁移、侵袭及凋亡的影响及能否靶向miR-450b-5p发挥作用，以期为结直肠癌的治疗提供新的分子靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年10月至2019年3月于我院行手术治疗的33例结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织。其中，男19例，女14例；平均年龄(56.49±8.24)岁。纳入标准：病理检测诊断为结直肠癌；均为首次确诊；术前未进行化疗、放疗等治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；合并肝脏、肾等重要脏器功能障碍者；合并自身免疫疾病。本研究经医院病理委员会批准同意，患者家属自愿签署知情同意书。

1.2 细胞与试剂 结直肠癌细胞系Caco-2，中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，美国Promega公司；RPMI 1640培养基、细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；LipofectamineTM 2000试剂盒和Trizol试剂，美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司；PCR引物、SLC16A1-AS1过表达载体(pcDNA-SLC16A1-AS1)、空载体(pcDNA-SLC16A1-AS1)、SLC16A1-AS1野生型质粒(WT-SLC16A1-AS1)、突变型质粒(MUT-SLC16A1-AS1)、miR-450b-5p 模拟物(mimcs)和模拟对照序列(miR-NC)，上海生工生物工程有限公司；兔抗人B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)抗体，美国Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR检测SLC16A1-AS1和miR-450b-5p表达:Trizol试剂提取组织中总RNA，逆转录为cDNA，行PCR扩增。扩增程序：95℃ 5 min，95℃10 s，58℃ 30 s，72℃30 s，共35个循环。引物序列：SLC16A1-AS1上游5’-TGGACGATGCATATGTGGGG-3’，下游5’-CACGTTGGTTATGCGGTCAC-3’；GAPDH上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；miR-450b-5p上游5’-GTAACCAGGGCGCAGCTC-3’，下游5’-CGGCGAGATGCTCGGC-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，下游5’-AACGATTCACGAATTTGCGT-3’。2-△△Ct法计算SLC16A1-AS1相对于内参GAPDH、miR-450b-5p相对于内参U6的表达水平。

1.3.2 细胞培养和转染:复苏Caco-2细胞，用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。将对数增殖期的Caco-2细胞以2.0×105个/孔接种于6孔板中，采用LipofectamineTM 200脂质体法，分别转染pcDNA(pcDNA组)、pcDNA-SLC16A1-AS1(pcDNA-SLC16A1-AS1组)、共转染pcDNA-SLC16A1-AS1与miR-NC(pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC组)、pcDNA-SLC16A1-AS1与 miR-450b-5p mimics(pcDNA-SLC16A1-AS1+ miR-450b-5p mimics组)，转染时间为6 h。然后更换培养基，再培养24 h，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞备用。同时RT-qPCR法检测pcDNA组、pcDNA-SLC16A1-AS1组SLC16A1-AS1和miR-450b-5p表达水平，方法同1.3.1。

1.3.3 双荧光素酶报告基因实验验证SLC16A1-AS1和miR-450b-5p靶向关系:将对数增殖期的Caco-2细胞以2.0×105个/孔接种于6孔板中，采用LipofectamineTM200脂质体法，分别共转染WT-SLC16A1-AS1与miR-450b-5p mimics或miR-NC、MUT-SLC16A1-AS1与miR-450b-5p mimics或miR-NC，转染时间为6 h。然后更换培养基，再培养24 h，收集细胞并裂解，参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书步骤，检测细胞荧光素酶活性。

1.3.4 流式细胞术检测细胞周期:将4组细胞以1.0×103个/孔接种于6孔板中，培养24 h后，收集细胞。PBS清洗1次，加预冷无水乙醇，4℃固定过夜。1 000 r/min离心5 min，弃上清，加PBS清洗细胞。1 000 r/min离心5 min，弃上清，加100 μl RNase悬浮细胞，37℃水浴30 min。加400 μl PI，混合均匀后，4℃孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞周期。

1.3.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭:调整各组细胞(pcDNA组、pcDNA-SLC16A1-AS1组、pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC组、pcDNA-SLC16A1-AS1+ miR-450b-5p mimics组)的密度为5×104个/ml。迁移实验：Transwell上室加100 μl细胞悬液，下室加入500 μl培养基。培养24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min，显微镜观察，随机取5个视野，计数。侵袭实验：预先在Transwell上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后，加100 μl细胞悬液，后续操作同细胞迁移实验。

1.3.6 流式细胞仪检测细胞凋亡:将各组细胞(pcDNA组、pcDNA-SLC16A1-AS1组、pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC组、pcDNA-SLC16A1-AS1+ miR-450b-5p mimics组)以5.0×104个/孔接种于24孔板中，培养24 h，收集细胞，PBS清洗2次。然后参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书步骤，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.7 Western Blot法检测Bcl-2和Bax蛋白表达:将4组细胞(pcDNA组、pcDNA-SLC16A1-AS1组、pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC组、pcDNA-SLC16A1-AS1+ miR-450b-5p mimics组)以5.0×104个/孔接种于24孔板中，培养24 h后，采用RIPA试剂提取细胞中总蛋白。BCA法测定蛋白含量后，行12% SDS-PAGE电泳，并将分离蛋白转至PVDF膜，然后于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h。分别置于Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液中，4℃孵育过夜。再置于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中，37℃孵育1 h。最后加显影液避光显影，曝光拍照。

2 结果

2.1 SLC16A1-AS1和miR-450b-5p在结直肠癌中的表达 与癌旁组织比较，结直肠癌组织中SLC16A1-AS1的表达降低(P<0.05)，而miR-450b-5p的表达升高(P<0.05)。见表1。

2.2 SLC16A1-AS1过表达载体转染效果及对miR-450b-5p表达的影响 与pcDNA组比较，pcDNA-SLC16A1-AS1组Caco-2细胞中SLC16A1-AS1的表达升高(P<0.05)，表明pcDNA-SLC16A1-AS1转染成功，过表达SLC16A1-AS1的Caco-2细胞构建成功。与pcDNA组比较，pcDNA-SLC16A1-AS1组Caco-2细胞中miR-450b-5p的表达降低(P<0.05)。见表2。

表1 结直肠癌中SLC16A1-AS1和miR-450b-5p的表达

表2 SLC16A1-AS1和miR-450b-5p的表达

2.3 SLC16A1-AS1靶向结合miR-450b-5p 与共转染WT-SLC16A1-AS1与miR-NC的细胞比较，共转染WT-SLC16A1-AS1与miR-450b-5p mimics的细胞荧光素酶活性显著降低(0.14±0.01 0.98±0.04，t=35.287，P<0.05)；而与共转染MUT-SLC16A1-AS1与miR-NC的细胞比较，共转染MUT-SLC16A1-AS1与miR-450b-5p mimics的细胞荧光素酶活性无显著变化(0.97±0.06比0.99±0.05，t=0.444，P=0.680)，说明SLC16A1-AS1可靶向结合miR-450b-5p。见图1。

图1 SLC16A1-AS1靶向miR-450b-5p

2.4 4组Caco-2细胞的细胞周期分布 与pcDNA组比较，pcDNA-SLC16A1-AS1组Caco-2细胞的细胞周期G0-G1期延长(P<0.05)，S期缩短(P<0.05)，而G2-M期无显著变化(P>0.05)。与pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC组比较，pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-450b-5p mimic组Caco-2细胞的细胞周期G0-G1期缩短(P<0.05)，S期延长(P<0.05)，而G2-M期无显著变化(P>0.05)。见表3。

2.5 4组Caco-2细胞迁移和侵袭数比较 与pcDNA组比较，pcDNA-SLC16A1-AS1组Caco-2细胞迁移和侵袭数降低(P<0.05)。与pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC组比较，pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-450b-5p mimic组Caco-2细胞迁移和侵袭数升高(P<0.05)。见表4。

表3 4组Caco-2细胞的细胞周期分布

表4 4组Caco-2细胞迁移和侵袭数比较 n=3,个,

2.6 4组Caco-2细胞凋亡率及凋亡蛋白表达水平比较 与pcDNA组比较，pcDNA-SLC16A1-AS1组Caco-2细胞凋亡率和Bax蛋白表达升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。与pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC组比较，pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-450b-5p mimic组Caco-2细胞凋亡率和Bax蛋白表达降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)。见表5，图2、3。

表5 4组Caco-2细胞凋亡率及中Bax和Bcl-2蛋白表达水平

图2 流式细胞术检测4组Caco-2细胞凋亡

3 讨论

lncRNA是真核生物中存在的一类长度>200个核苷酸的小分子非编码RNA，参与调控细胞增殖和凋亡等生命活动，在人类肿瘤的发生发展起重要作用[8]。研究已表明，多种lncRNA在结直肠癌中异常表达，可作为结直肠癌治疗的潜在分子靶点。Cheng等[9]研究显示，lncRNA NEAT1在结直肠癌组织和细胞中的表达上调，下调NEAT1表达通过靶向miR-195-5p并抑制CEP55的表达减弱结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，同时诱导细胞凋亡。Zhou等[10]研究显示，lncRNA PGM5-AS1在人结直肠癌细胞中低表达，上调其表达可靶向抑制miR-100-5p并促进SMAD4的表达降低结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Tang等[11]研究显示，lncRNA ADIPOQ在人结直肠癌组织和Caco-2细胞中的表达下调，上调ADIPOQ表达可通过负调控miR-219c-3p抑制Caco-2细胞增殖，迁移和侵袭。

图3 4组Caco-2细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达

作为一种lncRNA，SLC16A1-AS1参与调控多种肿瘤的发展进程。研究显示，SLC16A1-AS1在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞系中呈低表达，过表达SLC16A1-AS1可抑制NSCLC细胞的活力和增殖，阻断细胞周期进程并促进细胞凋亡，可作为NSCLC的潜在治疗靶点[12]。而SLC16A1-AS1在口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中呈高表达，沉默其表达明显降低OSCC细胞系CAL27和SCC25的增殖速率及集落形成能力，SLC16A1-AS1在OSCC中发挥促癌基因作用[13]。说明SLC16A1-AS1在不同肿瘤中发挥的作用不同。

本研究显示，结直肠癌组织中SLC16A1-AS1的表达明显高于癌旁组织，过表达SLC16A1-AS1阻滞了Caco-2细胞的细胞周期进程，降低了Caco-2细胞的迁移和侵袭能力，且诱导了Caco-2细胞凋亡，提示SLC16A1-AS1在结直肠癌中发挥抑癌基因作用，通过靶向上调其表达可抑制结直肠癌的发展进程。细胞凋亡是一种程序性死亡过程，受多种基因的调控。肿瘤细胞凋亡受阻，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的途径。Bax和Bcl-2参与调控细胞凋亡。Bax表达增加可增强线粒体膜的通透性，使细胞色素C进入细胞质激活Casoase-3，诱导细胞凋亡[14]。Bcl-2可与Bax结合形成异源二聚体，抑制Bax的促凋亡作用。本研究显示，过表达SLC16A1-AS1抑制了Caco-2细胞中Bcl-2蛋白的表达，而促进了Bax蛋白的表达，从侧面说明过表达SLC16A1-AS1可诱导Caco-2细胞凋亡，SLC16A1-AS1可作为结直肠癌治疗的分子靶点。

生物信息学软件预测显示，SLC16A1-AS1可能靶向结合miR-450b-5p。本研究首先利用双荧光素酶报告基因实验证实了SLC16A1-AS1可靶向结合miR-450b-5p；同时，过表达SLC16A1-AS1抑制了Caco-2细胞中miR-450b-5p的表达，说明SLC16A1-AS1在Caco-2细胞中靶向负调控miR-450b-5p表达。miR-450b-5p参与多种肿瘤的发展进程，且在不同肿瘤中的作用不同。研究显示，miR-450b-5p在胶质母细胞瘤中表达升高，抑制其表达可降低细胞的增殖和侵袭性[15]。而miR-450b-5p在宫颈癌[16]、肺腺癌[17]和肝细胞癌[18]等肿瘤中则表达降低，其作为抑癌基因参与这些肿瘤的发展进程。本研究显示，miR-450b-5p在结直肠癌组织中呈高表达，与吴萍[19]的报道一致，提示miR-450b-5p可能作为促癌基因促进结直肠癌的发生发展；过表达miR-450b-5p逆转了过表达SLC16A1-AS1对Caco-2细胞的细胞周期、迁移和侵袭的抑制作用及凋亡促进作用，提示过表达SLC16A1-AS1通过靶向抑制miR-450b-5p的表达来阻滞Caco-2的细胞周期，降低细胞的迁移和侵袭能力及诱导细胞凋亡。

综上所述，SLC16A1-AS1在结直肠癌组织中表达呈低表达，过表达SLC16A1-AS1可靶向负调控miR-450b-5p抑制结直肠癌Caco-2细胞的细胞周期进程、迁移和侵袭，并促进Caco-2细胞凋亡，SLC16A1-AS1/miR-450b-5p轴可能为结直肠癌的治疗提供了新的分子靶点。