呼吸机相关性肺损伤生物伤研究进展

欧顶琴 方育

尽管机械通气是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者的重要治疗措施，但其也可能导致呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)。VILI的病理特征是血气屏障的破坏，渗透性增加，从而引起肺水肿、白细胞浸润(主要是中性粒细胞)和出血，产生细胞因子如白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-8 (IL-8)、白细胞介素-1β(IL-1β)等和活性氧(ROS)[1]。VILI可分为气压伤，容量伤，肺不张伤，生物伤。高气道压通气可引起肺泡破裂，气体泄漏，导致气压伤(如气胸)[2,3]。高潮气量引起的肺泡过度膨胀导致的肺损伤称为容量伤[2]。低肺容量通气可通过反复开放和闭合气道和肺单位，造成肺不张伤[2]。同时，机械通气过程中的机械力可引起机体生物学应答，包括肺部白细胞募集(如中性粒细胞)和炎症介质的释放，全身炎性反应系统的激活，称为生物伤[2,3]。肺保护性通气策略主要从气压伤，容量伤和肺不张伤三方面预防VILI，其小潮气量通气可限制肺泡过度膨胀诱发的气压伤和容量伤，较高的呼气末正压通气(positive end expiratory pressure，PEEP)可预防低肺容量引发的肺泡反复开放闭合带来的肺不张伤，手法肺复张(用于再次膨胀已塌陷的肺单位的过程)涉及超过约35 cm H2O气道压的持续应用，可以膨胀肺不张区域，使肺通气的不均一性最小化[2]。然而，关于生物伤的发生机制尚不明确，并且其预防措施较少。现将从炎性反应、血气屏障功能障碍、内质网应激、氧化应激等在 VILI 中的作用进展综述如下，进一步阐明VILI生物伤的发生机制。

1 炎性反应

1.1 NF-κB信号通路 核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)家族是由RelA,RelB,RelC,NF-κB1,和NF-κB2等五名蛋白质成员组成。NF-κB在各种细胞类型中广泛激活,其在炎性反应过程中占据中心地位，可触发细胞因子、促炎酶、粘附蛋白、金属蛋白酶类、环氧合酶-2和诱导型一氧化氮合酶等调节炎性反应的因子的转录，参与炎性反应过程[4]。NF-κB信号通路的激活在高潮气量机械通气诱发的VILI疾病中扮演着重要角色。Ko等[5]研究发现机械通气可显著增加小鼠支气管肺泡灌洗液中的总细胞数(包括中性粒细胞)，细胞因子及总蛋白浓度，而对于敲除髓系细胞IкB激酶基因的小鼠，由于抑制了下游NF-κB信号通路，上述肺损伤指标显著下降，小鼠肺损伤减轻。Hayes等[6]通过4 h损伤性机械通气建立了大鼠VILI动物模型，并气管内滴注能够编码IκBα蛋白的腺病毒，过表达IκBα蛋白，抑制肺部下游NF-κB的激活 ，降低了肺泡-动脉氧梯度，减少了肺泡中性粒细胞浸润及炎症细胞因子的产生，缓解了肺损伤。另有研究表明，消退素D1，α1-抗胰蛋白酶，拓扑替康等药物可通过抑制NF-κB信号通路，减轻炎性反应，抑制高潮气量机械通气导致VILI[7-9]。上述研究提示NF-κB信号通路的激活可能是VILI疾病中炎性反应发生发展的关键原因之一。

1.2 Toll样受体 NF-κB信号通路上游Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是启动固有免疫应答的模式识别受体，能够识别多种配体，例如TLR4不仅能够识别脂多糖(LPS)等病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，也能够识别胞质热休克蛋白(HSP60和70)，核蛋白高迁移率族蛋白1 (HMGB1)等损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)。DAMPs介导的TLRs激活产生无菌炎性反应，可能是VILI重要发病机制之一[10]。Huang等[11]从高潮气量(40 ml/kg)机械通气4 h的大鼠支气管肺泡灌洗液中分离得到肺泡巨噬细胞，与对照组相比，通气组的大鼠肺泡巨噬细胞的TLR4,TLR9,Myd88和NF-κB等通路标记物的mRNA和蛋白表达水平显著上调，而使用抗TLR4的单克隆抗体预处理，可以明显减轻肺部炎性反应，降低细胞因子的产生，提示TLR4/Myd88/NFκB信号通路是VILI发生发展的重要分子机制。TLR4基因敲除小鼠也可显著减轻高潮气量机械通气诱导的肺部炎症细胞因子的释放，减轻肺损伤[12]。Camp等[13]研究发现，作为一种独特的内源性固有免疫分子，ARDS的候选基因，尼克酰胺磷酸核糖转移酶/前B细胞克隆增强因子(NAMPT/PBEF)能够在缺乏细菌感染(如LPS)和辅助因子的情况下直接结合并激活TLR4，诱导NF-κB的转录活动和肺部炎症损伤。利用髓样细胞触发受体1(TREM-1)的激动剂和拮抗剂，Wang等[14]证实TREM-1加剧小鼠VILI依赖于TLR4-MyD88-NF-κB信号通路。研究表明，LPS/VILI二次打击可诱发小鼠中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成[15]。利用TLR4敲除型和野生型小鼠，Li等[16]证实NETs的形成部分依赖于TLR4。以上结果表明了TLR4在 VILI的发生发展中的关键作用和重要枢纽地位。

1.3 NLRP3炎症小体 Nod样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体在VILI的炎性反应中发挥着重要作用。经典NLRP3炎症小体的活化分2步，首先，是依赖于NF-κB信号通路的NLRP3和 pro-IL-1β蛋白表达增加，再者钾离子的外流，ROS的产生等第二信号可直接激活NLRP3，活化的NLRP3通过凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)的caspase募集域(caspase recruitment domain,CARD)募集Pro-caspase-1形成炎症小体，激活的caspase-1可剪切pro-IL-1β、pro-IL-18，形成IL-1β和IL-18，参与炎性反应[17]。Kuipers等[18]分析了机械通气患者的肺泡上皮细胞和巨噬细胞，发现机械通气可上调NLRP3和ASC mRNA的表达。高潮气量通气情况下，与野生型小鼠相比， NLRP3炎症小体缺陷型小鼠VILI得到改善。Liu等[19]通过敲低NLRP3，在体内外实验中证实抑制NLRP3炎症小体，可以减轻细胞连接蛋白(p120-连环蛋白等)的降解，降低IL-1β的分泌，有效缓解VILI。NLRP3炎症小体的激活介导了VILI的炎性损伤。抑制NLRP3炎症小体的激活，可对VILI提供保护作用。

1.4 Wnt信号通路 生物信息学分析显示，经典和非经典Wnt信号通路激活参与了VILI发生发展过程。根据研究WNT/β-catenin信号通路激活参与了炎性反应过程中上皮细胞的损伤和增生，Villar等[20]通过对盲肠结扎诱导了脓毒症的SD大鼠，分别进行低潮气量(6 ml/kg)+10 cmH2O PEEP 或者高潮气量(20 ml/kg)+0 cmH2O PEEP机械通气4 h,证实了与对照组相比，高潮气量组WNT5A，β-catenin和MMP7蛋白表达水平升高，而低潮气量组WNT5A、β-catenin和MMP7蛋白表达水平显著降低。提示WNT/β-catenin信号通路激活参与了早期VILI炎性反应过程。Ding等[21]研究证实，在盲肠结扎和高潮气量机械通气二次打击小鼠肺损伤模型中，WNT1诱导分泌蛋白(WNT1 inducible secreted protein,WISP1或CCN4)和整合素β5蛋白表达水平升高，而使用抗WISP1和整合素β5的抗体预处理，可以部分减轻二次打击小鼠的炎性反应和肺部渗透性改变。利用离体腹腔巨噬细胞的试验表明，TLR4-MyD88-NF-κB通路激活介导了整合素β5的蛋白表达增加。重组WISP1蛋白增加了脂多糖诱导的腹腔巨噬细胞的细胞因子释放，而沉默TLR4或整合素β5基因可抑制上述现象。表明WISP1-TLR4-整合素β5通路参与了小鼠二次打击肺损伤炎性反应[21]。Xia等[22]使用12 ml/kg潮气量对敏感A/J小鼠进行机械通气，发现WISP1，ROCK1和JNK等非经典Wnt信号通路相关蛋白表达水平增加，而ROCK1和JNK抑制剂可减轻机械通气诱导的肺损伤，并降低非经典Wnt信号通路相关蛋白的表达，包括WISP1。非经典Wnt信号通路通过上调WISP1蛋白的表达参与了VILI的炎性反应过程。

2 血气屏障功能障碍

2.1 细胞间连接 细胞间连接结构包括紧密连接、黏附连接等。在脊椎动物中，上皮细胞层具有跨细胞屏障和细胞旁屏障特性，前者依赖于细胞顶端和基底侧的细胞膜，后者依赖于细胞间的紧密连接[23]。紧密连接是控制水、离子和大分子跨细胞旁转运的蛋白质结构[24]。紧密连接复合体包括3个组成部分：跨膜蛋白(如occludin,claudins)、胞浆蛋白(如zonula occludens,ZO蛋白)、肌动蛋白细胞骨架[25]。研究表明高潮气量机械通气可导致大鼠紧密连接蛋白occludin表达降低，渗透性增加[26,27]。肺泡上皮细胞通过锚定在肌动蛋白上的细胞间紧密连接维持血气屏障的完整性，机械牵拉可引起细胞骨架重构和紧密连接结构受损，导致上皮细胞旁屏障渗透性增加，来源于血浆的物质外渗至肺间质和肺泡腔，形成肺水肿。

E-钙粘蛋白·连环蛋白(E-cadherin·catenin)复合体是胞间黏附连接的主要成分[28]。钙粘蛋白是黏附连接的核心组分。钙粘蛋白通过胞质内的连环蛋白(p120-连环蛋白(p120-catenin),β-连环蛋白(β-catenin)和 α-连环蛋白(α-catenin)与微管或纤维状肌动蛋白(F-actin)间接连接。Gu等[29]通过C57BL/6小鼠高潮气量机械通气实验，证实了p120-连环蛋白在预防钙粘蛋白的内吞和降解，维持胞间黏附连接完整性方面具有一定作用。而周期性牵拉小鼠肺上皮细胞(MLE-12)和高潮气量机械通气小鼠可导致p120-连环蛋白降解。PKCα抑制剂可阻止c-Src激酶激活和p120-连环蛋白降解，c-Src激酶的抑制剂阻止了p120-连环蛋白降解，但对PKCα激活无影响。提示在VILI过程中PKCα激活c-Src激酶,进一步降解p120-连环蛋白,p120-连环蛋白的丢失可减弱细胞间黏附连接结构，引起屏障功能障碍，渗透性增加[30]。p120-连环蛋白在周期性牵拉引起的肺泡毛细血管屏障功能障碍中具有重要的保护作用。

2.2 VEGF-VEGFR2信号通路 在LPS和高潮气量机械通气二次打击小鼠肺损伤模型中，肺部浸润的 Ly6C+high单核细胞产生大量血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，致使血管的通透性增加[31]。Tian等[32]证实过度周期性拉伸血管内皮细胞可导致血管内皮生长因子受体2·VE-钙粘蛋白(VEGFR2·VE-cadherin)结构在细胞连接处解偶联，继而VEGFR2激活，VE-cadherin磷酸化，可从以下两个方面增加内皮细胞的通透性：一方面，VEGF-VEGFR2通路可激活Rho依赖信号通路；另一方面，VE-cadherin蛋白磷酸化和内吞，可减弱黏附连接结构。其次，抑制VEGFR2可减轻周期性拉伸诱导的内皮细胞屏障破坏。尽管VEGF被认为是一种促生存和血管生成因子，但高潮气量机械通气过度激活VEGFR2信号可能加重呼吸机诱导的肺部炎症和血气屏障功能障碍[33]。由此可推测，VEGF-VEGFR2信号通路激活同样是VILI血气屏障功能障碍的重要原因之一。

2.3 SIP信号通路 1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是一种天然存在的具有生物活性的鞘脂类，通过其5种G蛋白偶联受体(sphingosine-1-phosphate receptors,S1PR1-5)发挥胞外作用，同时作用于细胞内的多种靶点。在临床前急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)动物模型中研究发现，S1P是一种强有力的血管生成因子，可增强肺内皮细胞完整性，并抑制血管通透性和肺水肿[34]。S1P在细胞中的水平，依赖于鞘氨醇激酶 (sphingosine kinase,SphK) 1和2催化的合成反应与S1P磷酸酶和1-磷酸鞘氨醇裂解酶(sphingosine-1-phosphate lyase,S1PL)介导的分解代谢之间的平衡。研究发现经过4 h机械通气(30 ml/kg,0 cm H2O PEEP),小鼠肺组织中S1PL的表达增加，神经酰胺水平上升，而 S1P水平下降，导致肺部炎症、损伤和细胞凋亡。敲低S1PL基因的小鼠VILI减轻，敲低SphK基因的小鼠VILI加重。抑制S1PL的表达，增加细胞S1P水平，可能提供对VILI的保护作用[35]。然而，另一项小鼠二次打击VILI研究中，机械通气可使肺组织SphK蛋白表达水平上调和S1P水平升高，并与严重肺损伤有关[36]。进一步探究SIP信号通路在VILI渗透性增加中的作用，有助于阐明VILI的发病机制。

3 肺表面活性物质功能障碍

肺表面活性物质是一种主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成和分泌的脂质与蛋白质的混合物，其中脂质成分约占90%，脂质成分中>60%是二棕榈酰卵磷脂(DPPC)，表面活性物质结合蛋白(SP)约占10%。肺表面活性物质的主要功能是降低肺泡表面张力，减少肺泡回缩力。肺表面活性物质在肺泡内液-气界面的密度可随肺泡半径的变小而变大，半径增大而减小。呼气时肺泡缩小，表面活性物质密度变大，降低表面张力的能力增强，此时肺泡表面张力减小，从而防止呼气时肺泡发生萎陷；吸气时肺泡扩大，表面活性物质的密度变小，此时肺泡表面张力增大，从而防止吸气时肺泡过度膨胀。因此，肺表面活性物质可以维持肺泡的稳定性。VILI发生时，血气屏障破坏，渗透性增加，这使来源于血浆的物质渗漏到肺间质和肺泡腔中，其中的血浆蛋白可灭活肺表面活性物质，增加肺泡表面张力，导致肺泡和小气道塌陷。肺泡丧失了原有稳定性，可导致体积缩小肺泡体积越来越小，体积扩大肺泡体积越来越大，共同增加机械通气引起的组织压力，进一步损害上皮和内皮屏障[37]。

其次，机械通气可能导致内源性表面活性物质系统的损伤，这是机械通气导致急性肺损伤进展的机制之一。从高潮气量通气VILI大鼠模型中分离出板层小体，发现板层小体数量及其内表面活性物质降低表面张力能力受损。其原因可能是分泌增加导致板层小体的耗竭，而这种耗竭不能通过已受损的肺组织重新合成表面活性物质得到补偿，导致了表面活性物质系统受损[38]。肺表面活性物质功能障碍参与了VILI的病理过程。维护肺表面活性物质的正常功能，可为VILI的预防和治疗提供新思路。

4 内质网应激

内质网是蛋白质合成工厂。应激状态下，机体蛋白合成需求增加，内质网内错误折叠或未折叠蛋白积累，这种机制称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)，旨在恢复内质网的正常功能。然而，UPR的长时间激活会导致内质网应激[39]。内质网应激通过调节炎性反应与多种疾病相关。研究表明持续性拉伸上皮细胞和损伤性机械通气大鼠，可激活内质网整合应激反应(integrated stress response,ISR)，导致肺泡通透性增加，炎症应答和细胞死亡。而应用ISR上游关键分子蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)的化学抑制剂，可显著减少损伤信号，改善血气屏障功能[40]。后续研究证明拉伸诱导的上皮细胞内质网释放的Ca2+是PERK的激活剂，PERK是上皮细胞拉伸信号的传递者，PERK介导的ISR是VILI/ARDS的重要病理机制[41]。另一项研究中，内质网应激可通过IRE1α-TRAF2-NF-κB通路参与小鼠VILI的发生[42]。Xiaoli Ge等证实硫化氢可以通过PERK/eIF2α/ATF4/GADD34信号通路，抑制内质网应激，缓解VILI[43]。内质网应激是VILI发生发展的分子机制之一，改善内质网应激，可提供肺保护作用。

5 氧化应激与抗氧化

机械通气可导致机体活性氧(ROS)失控，水平升高[44]，可损伤DNA、蛋白质和脂质，并激活线粒体通透性转换孔(MPTP)，导致线粒体功能障碍，最终造成细胞死亡[45]。核因子E2相关因子(nuclear factor-erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是辅助超过200个抗氧化基因表达的转录因子，介导了机体的抗氧化功能。活性氧(ROS)大量产生与抗氧化功能失调是VILI发生发展的重要原因。An等[46]发现氧化应激通过激活NLRP3炎症小体，促进VILI的发生发展。研究表明吸入麻醉药七氟烷可以抑制机械通气引起的活性氧(ROS)的大量产生，缓解肺损伤[44]。另有研究表明激活转录因子3 (activating transcription factor 3,ATF3)缺陷可导致ALI/VILI的易感性，这与Keap-1蛋白表达增加和DJ-1蛋白表达下调，介导的Nrf2蛋白降解增加，抗氧化能力下降有关[47]。Tao等[1]通过腹腔注射Nrf2诱导物红木素(bixin)，减少了机械通气造成的小鼠肺组织充血，出血，炎症细胞浸润和肺泡间隔增厚等组织学改变，炎症应答及DNA氧化损伤。并且，在Nrf2基因缺陷型小鼠中未观察到红木素的保护作用，证实了红木素可通过诱导Nrf2发挥肺保护作用。研究人员证明应用Nrf2-抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)通路的激活剂叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)，可增加机械通气小鼠Nrf2依赖的抗氧化基因的表达，降低了高潮气量机械通气引起的支气管肺泡灌洗液中总蛋白浓度和细胞因子浓度的升高，减轻了肺部炎性反应和肺水肿[48]。由此可知，维持氧化还原反应平衡的关键机制是上调Nrf2依赖的抗氧化基因的表达。减少ROS的产生，增加机体抗氧化能力，可为VILI的防治提供新思路。

6 呼吸机相关性肺损伤RNA测序

遗传因素已成为VILI易感性和严重性主要研究热点[3]。为了研究清楚机械通气致肺损伤和肺纤维化的潜在机制，研究人员对经历了高潮气量机械通气的C57BL/6 小鼠肺组织进行了RNA测序。基因本体论(GO)分析认为刺激反应和免疫反应分别是影响炎症和纤维化的重要因素，京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析发现，mTOR,JAK/STAT,cAMP信号转导与早期炎症有关;而TGF-β,HIF-1,TLR,NF-κB信号通路明显参与急性肺损伤后续的肺纤维化过程。在细胞调控过程中，鉴定并富集了332种可能通过Wnt、HIF-1和TLR等信号通路调控纤维化的差异表达长链非编码RNA(lncRNA)[49]。Xu等[50]也进行了类似的研究。以上研究均为进一步探索VILI的分子机制提供了新方向。

综上所述，本文从炎性反应，血气屏障功能障碍，肺表面活性物质功能障碍，内质网应激，氧化应激等方面阐述了生物伤发生的部分机制。随着RNA测序技术的发展，非编码RNA的加入，将在后续研究中进一步阐明生物伤的形成过程。同时，LPS和高潮气量机械通气二次打击肺损伤动物模型，可能是更接近于临床ARDS的疾病模型，将帮助我们更好的探究VILI/ARDS的发病机制，以期为临床上肺损伤疾病的防治提供新思路。