微生物中一碳代谢网络构建的进展与挑战

郭姝媛，吴良焕，刘香健，王博，于涛

（1 中国科学院深圳先进技术研究院，深圳合成生物学创新研究院，合成生物化学研究中心，广东 深圳 518055； 2 中国科学院深圳先进技术研究院，深圳合成生物学创新研究院，中国科学院定量工程生物学重点实验室，广东 深圳 518055）

当前，随着工业制造技术的进步，全球的精细化工产品已达7万多种［1］，不仅能够满足人们的日常所需，同时也推动了经济的飞速发展。但是，大规模的化工生产导致化石资源（如煤炭、石油等）短缺，环境污染（如温室效应、空气污染等）加重，极大限制了未来经济的快速、绿色、可持续发展，打破了地球原有的生态平衡，威胁到人类的正常生活。因此，迫切需要发展绿色制造手段，弥补化工生产的不足，辅助推动传统工业制造大变革［2］。20 世纪伊始，生物制造被广泛应用于化工、医药领域，已经能够实现乙醇、丙酮等常见化工产品或抗生素等药品的生物转化。随着分子生物学技术和发酵工程领域的发展，利用常规生物系统，结合基因工程化改造和多样化的发酵手段，高效利用一碳化合物（甲烷、甲酸、甲醇与二氧化碳等）生物合成高附加值化学品，逐渐成为生物制造领域的研究热点。

一碳底物（one-carbon，C1）是一类具有单个碳原子的化合物，可分为：气态C1化合物，包括甲 烷（methane， CH4）、 二 氧 化 碳（carbon dioxide， CO2）、 一 氧 化 碳（carbon monoxide，CO）；液态C1化合物，包括甲醇（methanol，CH3OH）、 甲 醛（formaldehyde，HCOH）、甲 酸（formate，HCOOH）［3］。上述一碳底物都具有来源广泛、制备容易、价格低廉的特点，各自的特点决定了其在生物制造领域的应用前景。首先，基于CO 的研究，大多聚焦以合成气作为底物（CO 为主，含有H2、CO2等的混合气体），利用气态有氧或无氧发酵，实现化合物的生产［4］。但是，目前该方式存在的问题有产品种类较少（如乙醇、乙酸、2，3-丁二醇），产量较低，所用菌株多为杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii），不利于工程化改造［5］，因此本文不做重点讨论。CH4和CO2作为温室效应的主要气体，高效利用二者不仅可以缓解能源问题，还可以缓解温室效应，是当前研究的热点。但是，由于CO2本身较弱的亲电性而不易被激活，非自养生物在以CO2作为C1底物进行生物转化时，面临着能量供应缺乏、代谢供应不足、转化效率低、高能耗等多种问题［3］，因此，当前的研究大多聚焦于提高固碳效率［6-7］，CO2的催还还原［8］，CO2和甲酸的共应用［7-8］等方面，力求实现非自养微生物能够高效利用CO2生长，而仅以CO2作为碳源和能源进行化学品的高效生产鲜有报道。与CO2相比，甲烷作为天然气的主要成分，其本身富含能量、具有更强的还原性，在生物转化过程中能够获得更高的产量和转化率，美中不足，气态的甲烷不易存储和运输，且生物发酵过程中，气液界面物质交换的低速传递限制了其高效的生物利用。甲酸和甲醇均可来源于甲烷的氧化、劣质煤炭和生物废料的转化、CO2的还原等方式，二者来源丰富且富含高能，是生物转化的理想原材料［8-9］。相比于价格较为昂贵的甲酸，甲醇作为全球五大商品之一，其制备方式容易且多样化［10］，使得其成本日渐低廉，逐渐成为上述C1化合物中最具工业化应用潜力的底物原材料，因而大量研究聚焦于甲醇的生物转化。因此，针对丰富的C1底物，挖掘并构建高效的微生物细胞工厂，是推进C1化合物生物利用的关键。

甲基营养型微生物（methylotrophs）是一类能够利用C1化合物（甲醇、甲烷、甲酸和其他甲基化物质）作为唯一碳源和能源进行生长的微生物［11］，大致可分为两类：天然甲基营养型微生物和合成甲基营养型微生物。天然甲基营养型微生物可以通过自身的代谢途径实现对C1化合物的利用，而合成甲基营养型微生物是结合丰富的基因编辑手段，改造模式微生物，使其利用C1化合物高效生产目标产物。因此，探寻并发掘天然的甲基营养型微生物，解析其C1化合物的代谢途径，不仅有利于化合物的生产，也为后续打造合成甲基营养型微生物奠定基础；打造合成甲基营养型微生物，不仅有利于拓宽C1底物的利用范围，增强C1底物的利用率，而且有利于增加C1底物生物制造可行性，二者相辅相成。

因此，本文结合现有的研究成果，介绍了天然甲基营养型微生物利用甲醇、甲烷、甲酸和二氧化碳作为底物进行生物转化的关键酶和代谢途径，并概括了据此形成的多种化学品。其次，介绍了基于大肠杆菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）3 种常见的微生物构建合成甲基营养型微生物的多种形式及相应产物；最后，探讨了当前重点研究的CO2、CH3OH、HCOOH 3 种C1底物进行生物转化所面临的瓶颈与挑战，以期为后续的研究提供方向。

1 天然甲基营养型微生物的代谢网络

目前，研究发现多种天然甲基营养型微生物，通过自身的代谢途径实现对一碳化合物的利用。整体代谢网络大致上可分为3个模块：一碳底物的氧化模块（即甲烷、甲醇、甲醛的氧化）、同化模块（即C1化合物进入中心代谢的途径）、异化模块（即甲烷等一碳物质最终转变为CO2）［12］。甲烷、甲醇、甲酸和CO24 种一碳底物的代谢网络一脉相承，甲烷和甲醇经相应的氧化酶（如甲烷氧化酶、甲醇氧化酶等）转变后，均会形成甲醛，甲醛作为大多数甲基营养型微生物一碳代谢网络的中心代谢物，既可介导同化途径实现C1底物的生物利用，也可氧化形成甲酸，并经过甲酸脱氢酶生成CO2，有助于微生物脱毒（图1）。其中，同化途径作为主要的C1代谢模式，有氧条件下，主要包括

图1 天然C1利用途径Fig.1 C1 metabolic networks of native methylotrophs

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1.1 一碳化合物的氧化模块

1.1.1 甲烷的氧化

甲烷氧化菌中存在的甲烷氧化酶（methane monooxygenase，MMO）可以转变甲烷为甲醇，主要有两种形式：微粒型MMO（particulate MMO，pMMO）和可溶型MMO（soluble MMO，sMMO）［54］。前者广泛存在于甲烷营养菌中，是一种膜结合蛋白，但是该酶反应所需的辅因子尚未清晰；后者仅存在于特定类型的甲烷氧化菌中，需要NADH作为辅因子提供还原力；同时具有两种MMO 的甲烷氧化菌，其MMO 的表达受到胞内铜离子浓度的影响，铜离子浓度高，主要表达pMMO，铜离子浓度低，主要表达sMMO［55］。研究表明在细胞中表达pMMO 和sMMO 后，pMMO 对甲烷的氧化效率更高，细胞生长率强于sMMO［54］。

1.1.2 甲醇的氧化

甲醇氧化为甲醛是甲醇生物利用的限速步骤。前期研究表明，天然的甲基营养型微生物将甲醇转变为甲醛，主要有4 种甲醇利用酶：NAD 依赖的甲醇脱氢酶（methanol dehydrogenase，MDH）、吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）依赖的MDH、N，N-二甲基-4-亚硝基苯胺-氧化还原酶（N，N-dimethyl-4-nitrosoaniline oxidoreductase，MNO）及醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）［11］。前3 种存在于细菌中，AOX 主要存在于甲醇酵母当中。PQQ 依赖的MDH 主要存在于革兰氏阴性菌中（如Methylophilus methylotrophus），还原型PQQ（PQQH2）首先转移2 个电子至呼吸链上的细胞色素CL，然后经由细胞色素CL 传递2 个电子至最终电子受体，即氧化酶［56］，此时该酶转化O2为水。天然甲醇酵母利用AOX 将甲醇转化为甲醛，在此过程中，O2转变为副产物过氧化氢，有毒的过氧化氢被催化酶（catalase，CTA）分解成水和O2；值得注意的是AOX 和CTA 均定位在过氧化物酶体中，甲醇氧化过程也发生在过氧化物酶体中［57］。甲醇氧化酶-MNO 存在于部分革兰氏阳性甲基营养菌（如Amycolatopsis、Mycobacterium）中［58］，与NADPH 结合紧密［59］，结构与Ⅲ型乙醇脱氢酶类似［60］。NAD 依赖的MDH 主要来自于革兰氏阳性甲基营养菌（如Bacillus），转化过程中产生NADH，可存储于细胞中用于其他的代谢活动［56］。此外，当细胞内甲醛被快速消耗并维持在较低水平时，NAD-MDH 活性更佳，对甲醇的氧化能力更 强［56］。因 此，相 比 于PQQ-MDH 和AOX，NAD-MDH 在有氧和无氧条件下均具有氧化活性且反应机制容易，具有更加高效的能量转化能力［61］，已被广泛应用于合成甲基营养型微生物代谢底盘的构建。

当前，来自于B.methanolicus的NAD-MDH［62］已被成功用于E.coli甲醇代谢底盘的构建［63-64］。该酶活性依赖于内源的激活蛋白（anendogenousactivator，ACT），它可促进MDH 对甲醇的利用，但酶本身对于甲醇的亲和力较低，而对乙醇的亲和力更高［56］，因而所构建的工程菌甲醇转化率较低。为了进一步提高甲醇转化率，众多研究聚焦于该酶的筛选、挖掘、工程化改造，以期得到高效的NAD-MDH。James C.Liao 实 验 室［65］2016 年 报 道 了 来 源 于Cupriavidus necatorN-1 的NAD 依赖的甲醇脱氢酶（Mdh2），该酶来源于革兰氏阴性菌，可产生NADH，对甲醇的亲和力明显高于B.methanolicus，且不依赖于内源激活蛋白，特异性较强；随后，作者通过多轮易错PCR 构建Mdh2突变体文库，结合高通量筛选的方式，得到的Mdh2 CT4-1 对甲醇的亲和力比原先提高6 倍，Kcat/Km［L/（mol·s）］达到9.3（野生型为1.6），具有更好的催化活性和转化效率。Whitaker 等［66］2017 年在E.coli中分别引入来自革兰氏阳性菌B.stearothermophilus的BsMdh和B.methanolicus的BmMdh2，发现BsMdh具有更强的甲醇转化能力，通过体内实验表明BsMdh 的活性大约为16 mU/mg，而BmMdh2 的活性仅为8 mU/mg。此外，David R.Liu 实验室［67］利用噬菌体辅助的非连续进化的方式筛选BmMdh2 突变体，最终得到的BmMdh2 Q5L-A164P-A363L 突变体活性提高了3.5 倍，Kcat/Km［L/（mol·s）］达到1.08（野生型为0.23），但是低于CnMdh2 CT4（4.77）；随后，作者进一步通过体内同位素标记实验证明，在该酶的作用下，经过13C 标记的甲醇进入中心碳代谢的比例高于对照菌株（BmMdh wt、CnMdh2 CT4-1）2 倍多，说明虽然突变体活性低于Mdh2CT4-1，但是体内的甲醇利用率明显提高。

1.1.3 甲醛的氧化

甲醛是甲醇和甲烷作为C1底物进入中心代谢进行生物合成的中间代谢物，高浓度甲醛会抑制细胞生长，因此高效的甲醛代谢系统可以促进细胞对甲醇和甲烷的利用。大多细胞具有自身的甲醛氧化酶（formaldehyde dehydrogenase，FADH），可氧化甲醛形成甲酸，再经由甲酸脱氢酶形成CO2，完成甲醛代谢，促进微生物有效脱毒［61］。根据所需的辅助因子，FADH 可分为4 类：①需要NAD 作为辅助因子，包括仅以NAD 作为辅因子的FADH［68］、NAD-GSH 双 辅 因 子FADH［57，69］、NAD-硫醇依赖性FADH［70］；②不需要辅因子，可直接氧化甲醛；③细胞色素辅助的FADH（如PQQ-FADH），该类FADH 通常不是甲醛特异性酶，源自甲基营养菌，活性较低［70］；④四氢叶酸（tetetrahydrofolate，THF）、四氢甲氨蝶呤（tetrahydromethanopterin，H4MPT）作为辅助因子，该途径是最常见的甲醛氧化途径，广泛存在于多种甲基营养菌中。此过程中，以THF 或H4MPT 作为辅因子的微生物，甲醛经过亚甲基-THF（H4MPT）-脱 氢 酶［methylene-THF（H4MPT）dehydrogenase，Mtd］、亚甲基-THF（H4MPT）-环化酶［methenyl-H4MPT cyclohydrolase，Mch］，分别形成带有THF和H4MPT 的甲酰基化合物；前者经过甲酰-THF合成酶（formyl-THF synthase，Fhs）形成甲酸；后者经过甲酰-H4MPT 转移/水解复合体［formyl-THF（H4MPT）transferase/hydrolase-complex， Fhc］形成甲酸［70］。总之，由于甲醛毒性对微生物正常生长的影响，其体内均形成多种代谢甲醛的形式，为C1底物的生物利用提供了更多有效的研究策略。

1.1.4 甲酸的氧化

甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase，FDH）广泛存在于多种微生物中，可氧化甲酸为CO2，是细胞脱毒的最后一步，也是C1底物异化途径的最后一步。目前发现的甲酸脱氢酶可利用THF、NAD、NADP［71］、细胞色素等作为辅助因子，所生成的NADH或NADPH 可用于细胞其他的生命活动；以THF 作为辅因子的甲酸营养菌，通过rACoA途径即可实现微生物利用甲酸进行生长。

1.2 天然甲基营养型微生物的代谢途径

1.2.1 RuMP和XuMP途径

RuMP、XuMP 虽然存在于不同类型的甲基营养型微生物中，但本质上十分相似，都是甲醛结合五碳糖进行碳原子重排，一碳分子经由糖酵解途径完成碳流向下传递的过程，而五碳糖再生保证循环持续运转［61］。前者利用5-磷酸核酮糖（ribulose 5-phosphate，Ru5P）作为底物，甲醛经由己糖磷酸合成酶（hexulose phosphate synthase，HPS）转变为6-磷酸己酮糖（hexulose 6-phosphate，H6P）后，再通过磷酸己糖异构酶（phosphohexulose isomerase，PHI）转变为6-磷酸果糖（fructose-6-phosphate，F6P）进入中枢碳代谢。后者利用5-磷酸木酮糖（xylulose 5-phophate，Xu5P）作为底物，二羟丙酮合成酶（dihydroxyacetone synthase，DAS）可将甲醛和Xu5P 转变为3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）和二羟丙酮（dihydroxyacetone，DHA），DHA 可利用二羟丙酮激酶（dihydroxyacetone kinase，DHAK）进一步转化成DHAP，从而进入中心代谢。

RuMP途径中，3 mol甲醛形成1 mol丙酮酸时，伴随G3P、Xu5P 和4-磷酸赤藓糖（erythrose-4-phosphate，E4P）的形成；此外，已有研究报道，B.methanolicus［72］和P.pastoris［73］中均 存 在两 种酶，1，7-双磷酸景天庚糖酶（sedoheptulose 1，7-bisphosphatase，SBP） 和 转 醛 酶（transaldolase，TAL），前者可将1，7-双磷酸景天庚糖转变为7-磷酸景天庚糖（sedoheptulose-7-phosphate，S7P），后者将F6P 和E4P 转变为S7P 和G3P；S7P 和G3P 经由转酮酶（transketolase，TKL）重新转变为Xu5P 和5-磷酸核糖（ribose 5-phosphate，R5P），从而完成五碳糖的再生循环。因此，将磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway， PPP） 与RuMP 或XuMP相结合，加速五碳糖的再生，是提高C1底物利用率的常用策略，如Bennett等［74］通过表达多个PPP途径的酶提高内源Ru5P的含量，详见表2。

表2 合成甲基营养型细胞工厂及其产物Tab.2 Chemicals produced by synthetic methylotrophs

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XuMP 途径是甲醇酵母的主要甲醇代谢途径，其中涉及的AOX、CTA 及DAS 均定位在过氧化酶体中，DAS 活性可被葡萄糖抑制，被甲醇所诱导［57］。由于甲醇酵母中，甲醇代谢主要发生在过氧化物酶体中，区室化作用有利于降低甲醛毒性，可显著提高化合物产量，如番茄红素［84］。当前，P.pastoris已被用于多种化合物和蛋白质的生物合成（表1），如洛伐他汀［20］、透明质酸［17］等；关于汉逊酵母的研究较少，如利用汉逊酵母生产青霉素［22］。最近，大连化物所的周雍进研究组［85］开发了高效的汉逊酵母基因编辑工具，能够有效提高其同源重组效率，并利用其进行脂肪醇的生物合成研究。

表1 天然甲基营养型细胞工厂及其产物Tab.1 Chemicals produced by native methylotrophs

1.2.2 Serine途径和GLRP途径

广义的丝氨酸途径主要包括3 个部分：第1 部分是以C1化合物（甲烷、甲醇或甲醛）起始，经过多级氧化反应，形成亚甲基-THF（CH2-THF）的中间产物。第2 部分是以甘氨酸（C2）起始，结合1 分子CH2-THF，形成丝氨酸（C3），C3化合物经过一系列转化后，形成磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP），随后羧化引入1 分子CO2，形成C4化合物草酰乙酸（oxaloacetate，OAA），OAA 经过苹果酸脱氢酶转变为苹果酸（C4）（malate，MAL）。经过上述两部分后，完成两种C1化合物的利用。第3部分主要是乙醛酸的再生过程。MAL在苹果酸硫激酶（malate thiokinase，MTK）的作用下，形成苹果酸单酰-CoA。随后苹果酸单酰-CoA 被分解为C2化合物乙醛酸和乙酰CoA，乙醛酸经过丝氨酸-乙醛酸氨基转移酶（serine glyoxylate aminotransferase，SGA）形成甘氨酸，从而构成完整的丝氨酸循环［11］。

细胞中，乙酰CoA 参与多种生命活动，而经典的乙醛酸循环［86］可以利用乙酰CoA 和OAA 作为底物，经过柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）、顺乌头酸酶（aconitase，AT）和异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL），再生成琥珀酸和乙醛酸。但是，部分甲基营养菌（如M.extorquens）中缺乏异柠檬酸裂解酶，乙醛酸的再生是通过乙基丙二酰CoA 途径（ethylmalonyl-CoA，EMC）完成的，该途径也被称为GLRP［11，86］。EMC 途径不仅存在于天然甲基营养菌中，部分非甲基营养菌也拥有该途径，如红杆菌（Rhodobacter）和链霉菌（Streptomyces）。该途径大约有10 步反应，中间产物涉及C2、C3、C4化合物，包括多种独特的辅酶A中间体，可用于多种工业化合物的生产［87］，如聚羟基烷酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）、3-羟基丁酸（3-hydroxybutyrate，3-HB）［30］、3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）［36］等，见表1。

1.2.3 rACoAP途径

许多天然的甲酸和甲烷营养菌中均存在还原型乙酰CoA 途径，即Wood-Ljungdahl pathway，该类菌株可以利用甲酸作为唯一碳源和能源进行生长。该途径中，以THF 作为辅助因子，甲酸转变为CH2-THF 后，可以进一步转化为5-甲基-THF。随后，结合CO 和CoA 直接形成乙酰CoA，乙酰CoA 在丙酮酸合酶（pyruvate synthase，PC）的作用下，羧化结合1 分子CO2，最终形成丙酮酸［88］。在此过程中，不仅可以利用甲酸，同时可以结合2分子CO2（CO 可来源于CO2），具有充分的一碳利用能力。能量方面，虽然该过程第1步（甲酸转化为甲酰-THF）需要消耗1分子ATP，但是随后可产生NADPH 用于后续能量供应。目前，已有研究报道利用该途径进行香叶醇的生物合成［53］。

1.2.4 CBB途径和rPPC途径

存在另一种广义的CBB循环，又称为还原型磷酸戊糖循环（reductive pentose phosphate cycle，rPPC），是甲酸营养菌（Cupriavidus necator）［8］和少数甲烷营养菌［89］的另一种固碳形式。甲酸氧化形成CO2后，结合1，5-二磷酸核酮糖（ribulose-1，5-bisphosphate，RuBP）在1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCo）的作用下，转变为G3P进入中心碳代谢途径。但是，该途径需要消耗过多的还原力和ATP，既不经济，也不利于微生物生长［88］。最近有研究报道，在P.pastoris中引入RuBisCO 和磷酸核酮糖激酶（phosphoribulokinase，PRK），首次实现天然甲醇酵母利用CO2作为唯一碳源即可生长［90］。

2 合成甲基营养型微生物的代谢网络

天然的甲基营养型微生物具有丰富的C1代谢酶和代谢途径，理论上，据此构建下游的生物合成途径，即可实现微生物利用C1底物作为唯一的碳源和能源支撑生长并高产目标化合物。但是，由于天然的甲基营养型微生物存在数据库资源和遗传信息不完善、基因编辑工具缺乏与产物转化率低下等问题，使C1底物大规模应用于工业生产这一目标至今没有实现。因此，结合天然甲基营养型微生物中发现的C1代谢途径，如RuMP、丝氨酸途径，赋予模式微生物对C1化合物的高效利用能力，从头构建合成型甲基营养微生物，并实现目标化合物的高产，逐渐成为研究热点。此外，近几年的研究中，通过计算机设计全新的酶蛋白，打造人造C1代谢途径，亦成为高效利用C1底物的又一有效策略。当前，大多数研究均在E.coli当中开展，仅有少量研究以C.glutamicum和S.cerevisiae作为研究对象，研究的主要内容包括两个：①以C1底物作为唯一碳源和能源支撑微生物快速生长，涉及的C1底物为甲醇、甲酸和CO2；②高效利用甲醇和CO2（甲酸辅助）进行生物合成。因此，本部分概括了上述3种模式生物作为研究对象，针对两个主要研究内容，所进行的代谢网络构建和生物合成探究。

2.1 大肠杆菌

目前，E.coli是研究最深入的原核模式生物，多种C1底物（甲醇、甲酸、CO2）的生物利用已经在E.coli中陆续开展。其中，关于甲醇的研究成果最为丰富，涉及代谢途径的挖掘、代谢底盘的改造与优化、共培养底物的优化、生物合成化合物等多个方面，并且已有研究报道E.coli可以利用甲醇作为唯一碳源和能源正常生长［91］。关于甲酸和CO2的研究成果相对较少，研究侧重于甲酸或CO2的充分利用、已知代谢途径的改造及新途径的挖掘［92］，当前已经实现E.coli可以利用甲酸［93］或CO2［94-95］作为唯一碳源生长，但是生长情况较弱，有待进一步提高。

2.1.1 甲醇

工程化改造E.coli，形成合成型甲醇营养菌的研究策略可以分为两种：引入天然甲醇利用通路和打造全新的甲醇代谢途径。前一种主要是通过引入或塑造天然存在的甲醇利用途径（如RuMP、XuMP），结合代谢底盘的辅助改造，代谢流微调，底物和发酵条件优化，目标产物合成途径的构建等，最终实现E.coli能够在含有甲醇的培养基中生长并合成目标产物；后一种主要是结合计算机辅助设计和蛋白质工程，发现能够提升甲醇代谢能力或缩短已知代谢途径的酶，从而打造全新的甲醇代谢途径，弥补天然途径中的不足，以期实现更高的甲醇利用效率，包括甲醇缩合循环（methanol condensation cycle， MCC）、 甲 醛 酶途径（formolase，FLS）、合成型乙酰CoA 途径（synthetic acetyl-CoA，SACA）、羟酰辅酶A裂解酶途径（2-hydroxyacyl-CoA lyase，HACL）、修饰丝氨酸循环（modified serine cycle，MSC）（图2）。

图2 合成C1利用途径Fig.2 C1 metabolic networks of synthetic methylotrophs

天然甲醇利用途径在前面已经有详细的介绍，不再赘述。当前，大量研究聚焦于整合RuMP 于E.coli中，以期实现E.coli利用甲醇作为唯一碳源和能源支撑微生物生长；2015 年的研究通过在E.coli中整合多种不同来源的RuMP 中的关键基因，发现来源于B.methanolicus菌株的MDH2、HPS、PHI能够更好地利用甲醇［63］；2018 年的研究表明，通过增强甲醛的消耗，降低TCA 代谢，减少NADH 的产生可以促进甲醇利用［96］；随后，通过在E.coli中加入甲醛感应元件，降低NADH 的产生，并加强Ru5P 的再生，进一步提高甲醇的利用［97］；2020 年8 月，Liao 团队［91］发表在Cell上的文章，首次实现了甲醇作为唯一碳源支持E.coli生长，并且在8.5 h 中OD 值可达到2。上述研究从“零”到有实现了E.coli利用甲醇作为唯一碳源支撑微生物生长的能力。此外，已有众多研究报道E.coli利用甲醇（葡萄糖或酵母提取物作为辅助碳源）进行生物合成，对底盘的改造均以RuMP途径为基础，包括柚皮素、乙醇、丙酮、琥珀酸、赖氨酸等，见表2，但是均未实现甲醇作为唯一碳源。值得关注的是，2018年Nature Communications首次报道了基于MSC 构建合成型甲醇营养菌生成乙醇，此前大多改造均利用RuMP途径，因而该文章是天然甲醇利用途径的应用突破［79］。

最早的合成途径来自Liao 实验室的MCC 途径，其将非氧化糖酵解（nonoxidative glycolysis，NOG）途径和RuMP 途径结合，利用体外无细胞体系实现甲醇的利用。该途径中，F6P或X5P可通过一步反应直接生成乙酰磷酸，随后转化为乙酰CoA，不仅避免丙酮酸脱羧所造成的碳损失，同时减少ATP 的消耗；但是至今没有研究报道该途径在体内的应用情况。随后，美国David Baker 实验室设计并人工合成了以甲醛酶为核心的FLS 途径，仅通过2 步即可实现甲醛到二羟丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）的转化（消耗1 分子ATP），而RuMP 途径中从甲醛到DHAP需要4步反应，因而该反应极大缩短了C1底物进入中枢代谢的步骤；同时，此途径可以甲酸作为底物，经过乙酰CoA 合成酶（acetyl-CoA synthase，ACS）和乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ACDH）转变为甲醛，过程中需要消耗1 分子NADH［98］。2019 年报道了两条合成途径，一条来自天津工业生物技术研究所江会峰团队［99］报道的SACA 途径，通过计算设计合成的乙醇醛合成酶（glycolaldehyde synthase，GALS）、乙酰磷酸合成酶（acetyl-phosphate synthase，ACPS）可以通过三步反应快速转化甲醛为乙酰CoA，不需要消耗ATP、无碳损失，可惜的是文章中仅在体外实验中验证了该途径的作用，而在E.coli中没有明显的甲醇利用效果；另一条途径来自美国Ramon 实验室所设计的HACL 途径，该实验室筛选两种酶，RuHACL和酰基辅酶A还原酶（acyl-CoA reductase，ACR），首次实现C1化合物甲醛至C2化合物乙醇酸（glycolate）的转变，该途径同样可用甲酸为底物，经由甲酰CoA转变为甲醛［81］。

2.1.2 甲酸和二氧化碳

目前，E.coli主要是通过还原型甘氨酸途径（reductive glycine pathway，rGlyP）利用甲酸和CO2，仅有少量研究借助CBB循环实现一碳物质的转化。首先，rGlyP 可以利用甲酸和CO2两种C1化

合物，代谢途径整体结构与rACoAP 类似，同样是借助THF 作为辅助因子，通过引入THF 循环，从而实现甲酸和CO2的利用［8］。该途径有3 个优点：①仅通过一个酶，甘氨酸裂解酶复合体（glycine cleavage system，GCS）即可完成中间产物CH2-THF向C2甘氨酸的转化，而rACoAP涉及众多辅助酶且许多至今未知。②与丝氨酸途径和CBB 途径相比，该途径更加经济节能，具有高效的甲酸利用能力；该途径产生1 分子乙酰CoA 需要消耗6 分子甲酸，而前两者分别需要11 分子甲酸和7 分子甲酸［8］。③该途径的中间产物（甘氨酸、丝氨酸）与中心代谢关联较少，不像rACoAP（乙酰CoA）和丝氨酸途径（苹果酸、乙醛酸等）的中间产物与多种代谢有密切联系，因而可以避免考虑复杂的代谢流。2018年，Arren Bar-Even实验室［100-101］通过在E.coli中构建rGlyP，在体内证明了该途径可以利用C1底物支撑微生物生长。同年，Lee Sang Yup实验室［102］在E.coli中引入rGlyP 和FDH（Candida boidinii），首次实现了E.coli仅利用甲酸和CO2即可轻微生长（不需要添加葡萄糖）。2020 年先后发表了两篇文章，通过引入不同来源的酶构建rGlyP，引入不同来源的FDH 达到提供能量和还原力的作用，均实现了E.coli利用甲酸作为唯一碳源支撑微生物生长；2020年初的文章中，利用ALE实现改造菌株在甲酸和CO2中生长的倍增时间不到8 h，生物量达到2.3 g CDW/mol 甲 酸［93］；Lee Sang Yup 实 验室［103］2020 年中所发表的文章是2018 年工作的延续，作者进一步对底盘进行改造，引入多种来源的FDH 并调整胞内细胞色素泛素氧化酶（bo3、bd-I）的表达水平，最终菌株仅以甲酸和CO2作为碳源，OD 能够在450 h 达到7.38（1.3 L 发酵罐）。关于利用CO2作为主要碳源的研究较少，现有的两篇通过在E.coli中引入CBB 循环固定CO2；2016 年Ron Milo实验室首次实现E.coli利用CO2（丙酮酸作为辅助底物）合成中枢代谢的各种糖类物质，此时能量部分由丙酮酸所介导的TCA循环所提供［94］；2019年，该实验室利用CO2和甲酸一起作为底物，结合ALE，最终实现E.coli利用CO2作为唯一碳源支撑生长的目的，此时由甲酸氧化提供能量［95］。

此外，研究发现了几种人工改造的合成型甲酸和CO2利用途径，目前关于这些途径的研究多聚焦于体外研究，没有被大量应用于生物合成。大致可分为3类：

（1）甲酸和CO2作为共同底物 包括丝氨酸-苏氨酸循环（serine-threonine cycle，STC）、丙酮酸-甲酸裂解酶（pyruvate formate-lyase，PFL）-苏氨酸循环（PFL-threonine cycle，PTC）、酮丁酸-甲酸裂解酶（ketobutyrate formate-lyase，KBFL）循环（KBFL cycle，KBFLC）。其中，STC 类似与丝氨酸循环，THF 作为辅助因子，利用甲酸和固定CO2的方式与之相同，不同点在于OAA 裂解形成天冬氨酸而不是MAL；PTC 循环中甲酸的利用方式不同于STC 循环，不需要THF 作为辅助因子，甲酸和乙酰CoA 在PFL 的作用下直接形成丙酮酸；KBFLC 不同于上述途径，丙酰-CoA 和甲酸在KBFL 的作用下2-酮丁酸，随后固定无机碳源，终产物为乙醛酸（图3）。

图3 合成甲酸利用途径Fig.3 Synthetic metabolic networks for formate utilization

（2）仅利用甲酸作为底物 如PFL-磷酸转酮酶（phosphoketolase，PKT）循 环（PFL-PKT cycle，PPC），该途径中，PKT 转化Xu5P 为酰基磷酸和G3P，酰基磷酸可以转化为乙酰CoA，从而和甲酸在PFL 的作用下形成丙酮酸；此外，甲酸可还原为甲醛，从而通过RuMP、FLS途径代谢。

（3）仅以CO2作为底物 巴豆酰基CoA-乙基丙二酰CoA-羟基丁酸酰基CoA（crotonyl-CoA/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA，CETCH） 循环［104］。由于甲酸和CO2之间的相互转化关系，赋予了上述途径更加丰富的利用空间。

2.2 谷氨酸棒状杆菌

目前，关于C.glutamicum的C1利用研究主要聚焦于甲醇的代谢。2013年Bott实验室［105］研究发现，C.glutamicum内源存在甲醇转化为CO2的一系列酶，乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADHA）可以催化甲醇转变为甲醛，甲醛可由乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALD）或以硫醇作为辅因子的FADH（adhE）转变为甲酸，随后甲酸经内源FDH（fdhF）转变为CO2；该文章首次完整展示了C.glutamicum中甲醛脱毒的所有基因，为后续的改造研究奠定了基础。随后的研究中，通过敲除adhE和ALD，阻断C.glutamicum中甲醇至CO2的转化途径，并引入RuMP，以葡萄糖或核糖辅助甲醇利用，利用甲醇合成尸胺［75］；以木糖和甲醇作为主要碳源，生物合成谷氨酸［76-77］；2020年孙际宾团队［76］通过适应性进化，将菌株所耐受的甲醇浓度提高到15 g/L，且甲醇与木糖利用率为7.04∶1；大大提高了甲醇的利用效率。但是，截至目前，并没有研究实现C.glutamicum以甲醇作为唯一碳源和能源支撑其生长。

2.3 酿酒酵母

作为真核模式生物，S.cerevisiae具有详细的基因信息，完善的数据库和多样的基因编辑工具，被广泛应用于细胞工厂的构建。由于S.cerevisiae本身对甲醇和甲醛具有更高的耐受性［106］，因此S.cerevisiae在C1的生物转化中具有广阔的应用前景。当前，仅有少量文献报道了关于合成型“甲醇酵母”的研究，研究内容停留在S.cerevisiae的菌株选择和生长两个方面，没有实现任何一种C1化合物作为唯一底物原材料即可支撑微生物正常生长目的。南京工业大学姜岷实验室［107］首次在S.cerevisiae中引入RuMP 和XuMP，赋予其对甲醇的利用能力，但是其在甲醇当中的生长能力有待提高。澳大利亚的Paulsen 实验室［108］结合转录组学数据，对比了两类常见的酵母品系（CEN.PK 和S288C）在甲醇当中的生长情况，发现CEN.PK 更适合用于构建合成型“甲醇酵母”。随后，Paulsen实验室［109］发表在Nature Communications 的研究，通过对S.cerevisiaeCEN.PK113-5D 进行适应性进化，发现其具有天然的甲醇利用能力，进化后可在含有甲醇和酵母提取物的培养基中生长。此外，Arren Bar-Even 实 验室［110］研究 表明，rGlyP 在S.cerevisiae中具有很强的甲酸代谢能力，该研究首次报道了S.cerevisiae通过rGlyP 利用甲酸和CO2。因此，根据已有的C1 代谢途径重构S.cerevisiae代谢底盘，并结合ALE，能够进一步发掘其对C1底物的利用潜力［111］。

3 结语

本综述总结了基于天然和合成型甲基营养型微生物利用C1底物进行生物合成的主要代谢网络及现有产品。已发掘的天然甲基营养菌大多直接利用甲醇或CO2作为C1底物，通过自身所具有的一磷酸核酮糖途径、丝氨酸途径和还原型乙酰CoA途径，完成C1底物向中枢代谢的转运，产物主要为氨基酸类（如丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸等）、PHA 或PHB；天然甲醇酵母主要利用一磷酸木酮糖途径，产物除了氨基酸和小分子有机酸，还有他汀类药物。虽然天然甲基营养型微生物能够高效利用C1底物，但是缺乏完善的基因组信息和基因编辑工具，因而在进一步提升底物利用率、目标物产量及产物转化率方面，都具有较大的困难。当前，随着高通量测序和多组学技术的发展，针对已被广泛应用的天然甲基营养型微生物建立数据库，提供更加全面和丰富的基因信息，可以有效提高其生物合成的应用范围；此外，基于天然甲基营养型微生物开发高效的基因编辑工具，提高菌株自身的同源重组效率，可以有效增加其用于生物合成的操作可行性。近年来，关于毕赤酵母的基因信息和数据库资源日渐丰富，已有多项研究聚焦于优化毕赤酵母的基因编辑方法，如开发高效的CRISPRi（clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference）系 统［112-113］；敲除Ku70（ATP 依赖的DNA 解旋酶）［114］、引入Rad52（DNA修复蛋白）提高非同源重组效率［115］；此外，针对天然甲基营养菌的基因编辑手段也逐渐增多，如优化CRISPRi系统中dCas9 启动子［116］、开发sRNA（small regulatory RNA）系统用于抑制基因表达［117-118］。合成甲基营养型微生物能够弥补其在基因编辑上的不足，但是却存在C1底物利用效率低的问题，导致微生物不能以甲醇或CO2作为唯一碳源和能源快速生长。当前，虽有少量研究实现E.coli利用甲醇或CO2进行生长，但是距离产物合成及工业化应用还有较远的距离。目前，合成型甲基营养微生物的研究策略主要依赖于代谢底盘的改造（如天然甲醇利用途径的引入）、打造全新的代谢途径（如还原型甘氨酸途径，甲醛酶途径）、关键酶的挖掘（如高效MDH 的筛选）、适应性进化（如葡萄糖、木糖等多底物偶联进化）等；最近的文章将纳米材料应用于CO2的固定，结合多条已有的C1利用途径，有效提高了CO2的转化效率，展示了纳米材料在生物转化研究中的应用前景［119］，为未来的C1化合物的高效利用提供更有效的思路。

值得注意的是，两种类型的甲基营养型微生物都面临同样的问题，即底物毒性耐受性问题。多种C1底物，如甲烷、甲醇的代谢网络一脉相承，高度的相似性伴随而来的是甲醛毒性的问题，甲醛积累而引起的细胞毒性，是导致微生物不能正常生长的根本原因，也限制了甲基营养微生物底物利用率的提高［120］。因此加强细胞对毒性物质的代谢能力，或者提高细胞对毒性物质的耐受性，是实现C1底物高效利用的重中之重［121］。针对这一问题，目前的主要手段均为适应性进化，虽然能够在一定程度上提高微生物的甲醛耐受能力，但是所需时间较长，且现有研究均没有突破甲醛毒性所带来的生长限制；未来，利用多种诱变手段加快进化速度，加强对甲醛致毒机制的剖析，同时结合不同微生物自身的特点（如酵母的区室化效应）［122］，是微生物突破生长瓶颈的有效途径。总之，充分提升C1底物利用率和目标产物转化率，以生物制造推动新型工业化改革，对世界经济的可持续发展具有重要意义。