个性化结直肠癌肿瘤疫苗的制备

盛 慧,赵智辉

(南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子与医学生物技术重点实验室,江苏 南京 210023)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)作为一种常见的消化道恶性肿瘤之一,根据2018年中国癌症统计的结果显示,中国结直肠癌发病数占全球24.3%,死亡数占全球22.9%,并呈逐年上升趋势[1]. 由于临床表现不典型,多数结直肠癌患者在初诊时已经发展为局部晚期或晚期,导致治愈率和生存率较低[2-3],目前的主要治疗手段并不能使大多数患者显著获益[4-5]. 伴随免疫学和肿瘤学发展,肿瘤免疫疗法已成为治疗癌症的新趋势,主要有癌症疫苗、细胞疗法、细胞因子和免疫检查点抑制剂治疗[6-8]. 肿瘤疫苗具有副作用少、抗肿瘤特异性强等诸多特点,在预防肿瘤复发方面也具有优势[9-11]. 开发治疗性肿瘤疫苗的关键是确定抗原,理想的抗原应具有较强肿瘤特异性的新抗原,能够诱导机体产生较强的抗肿瘤T细胞反应. 但是,由于鉴定具有免疫原性的肿瘤新抗原以及相应的肿瘤疫苗研制周期和成本等问题,很难造福晚期肿瘤患者[12]. DCs是自然界中已发现的功能最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC),也是唯一能够活化初始型T细胞的APC,其表面分子能够处理提呈肿瘤细胞,分泌多种细胞因子,是特异性免疫应答反应的始动者[13-14]. 同时,细胞表面的免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)Fcγ 受体(Fc gamma receptors,FcγRs)通过介导抗原-抗体免疫复合物与免疫细胞及其他细胞间的相互作用,引起多种免疫应答[15-16]. 肿瘤细胞膜上糖链的高度唾液酸化修饰会使得肿瘤细胞黏附、侵袭、迁移等多种功能发生变化[17-19]. 另外,利用生物正交反应将两种可以发生特异性反应的化学基团分别修饰待缀合的分子,两种标记后的分子可以在接近生理条件下通过正交基团共价结合[20-22]. 从研究策略上,将特定的激活性吞噬受体的配体和广谱肿瘤抗原直接缀合.

基于此,本研究课题通过构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker,表达出可以靶向DCs表面激活性吞噬受体FcγRI的融合蛋白mlgG1Fc,接着,进行化学修饰,使其标记上炔烃,再N3-TAg进行点击反应,制备出个性化且可以靶向DCs的结直肠癌肿瘤疫苗.

1 材料与方法

1.1 主要试剂

F-12K培养基、Opti-MEM培养基购自Gibco,抗生素(Penicillin-Streptomycin Mixed solution(100×))购自北京博奥森生物科技公司,RPMI Medium Modified培养基购自Hyclone公司,胎牛血清购自康源生物,0.25%细胞胰酶消化液购自碧云天公司,蛋白Marker购自南京思科捷公司,Lipofectamine 2000购自 Invftrogen 公司,蛋白酶抑制剂购自Bimake公司,Protein G 4ff chromatography column购自翊圣生物,BCA试剂盒、Protein A+G beads、Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)-HRP、IGF-1R Polyclonal Antibody、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP均购自南京Bioworld公司,Goat IgG anti-Mouse IgG1(Fc)antibody购自德国Dianova公司,Click-iT® DIBO-amine、Alexa Fluor® 488 Azide(Alexa Fluor® 488 5-Carboxamido-(6-Azidohexanyl),Bis(Triethyl ammonium Salt)),5-isomer购自Thermo fisher,构建质粒所需试剂均由南京Bioworld提供,结合缓冲液、RIPA裂解液均由本实验室配制,tetraacetylated N-Azidoacetyl-D-Mannosamine(Ac4ManNAz)由北京大学药学院李中军教授课题组合成.

1.2 主要方法

1.2.1 细胞培养

小鼠CT26.WT结直肠癌细胞株(购自武汉普若赛)在37 ℃、5%CO2条件下,用含10%FBS和1×抗生素的RPMI Medium Modified培养基常规培养.

CHO-K1细胞株(购自上海中国科学院细胞库)在37 ℃、5%CO2条件下,用含10%FBS和1×抗生素的 F-12K培养基常规培养.

1.2.2 pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker的构建

从Uniprot和NCBI数据库调取小鼠IgG1Fc基因编码序列和蛋白序列,进行比对分析.选用编码序列与Linker序列以及信号肽序列进行拼接,同时在拼接片段两端加上与表达载体克隆位点相应的酶切位点序列(包含保护碱基),设计一对含KpnI(5′-GGTACC-3′),EcoRI(5′-GAATTC-3′)酶切位点的PCR引物,用以亚克隆mlgG1Fc-linker基因序列.

上游引物:5′-AAACGACACCCCCATCTGTC-3′,

下游引物:5′-ATGGTGAGCACATCCTTGGG-3′.

PCR扩增含酶切位点的mlgG1Fc-linker基因,将正确大小的目的条带割胶后进行纯化回收,通过琼脂糖凝胶电泳实验来鉴定回收片段. 将正确大小的回收产物和pcDNA3.1(+)表达载体进行双酶切反应,T4连接酶连接pcDNA3.1载体及目的片段. 将已构建的重组表达载体pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker转化大肠杆菌DH5α感受态细菌,涂布于含抗生素的LB板子上,于37 ℃振荡摇床上培养12 h,用枪头挑取单克隆菌落,经小提后的质粒送至公司测序,测序结果与设计的目的基因片段进行序列比对分析,将构建的重组表达载体命名为pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker.

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳

称取0.2 g琼脂糖于锥形瓶中,加入20 mL 1×TAE电泳缓冲液,放置微波炉里加热煮沸,共3次,再加入1 μL核酸染料,将缓冲液转移至凝胶板中,装上梳子,凝固后,将质粒DNA样品、DNA Marker按照合适的顺序进行上样,125 V电泳25 min,将电泳结束后的凝胶置于成像仪中观察实验结果.

1.2.4 mlgG1Fc-linker的表达

按DNA质量与Lipo2000体积比9 μg∶20 μL,将pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker转染CHOK1细胞,转染培养6 h后,更换新鲜的F-12K完全培养基,分时段收集细胞培养上清液,加入1/100体积的蛋白酶抑制剂,保存于-80 ℃冰箱中.

1.2.5 mlgG1Fc-linker的纯化

收集一定量表达mlgG1Fc的CHOK1细胞培养液上清,按上清液量加入1/10体积的1 mmol/L Tris-HCI(pH 8.5)的缓冲液,调节样品pH值至偏碱性. 连接蠕动泵和Protein G 4FF Chromatography Column预装柱,依次进行上样、PBST洗杂、Glycine-HCI洗脱、中和液中和,将含有目的蛋白mlgG1Fc的洗脱液进行BCA定量后,保存于-80 ℃冰箱中.

1.2.6 在固相系统中完成对mlgG1Fc化学标记

取80 μL Protein A+G beads于0.6 mL EP管中,4 ℃,2 000 rpm离心3 min. 将其均分至2个0.6 mL EP管中,一管作为实验组,加入50 μg mlgG1Fc蛋白;另外一管作为对照组,4 ℃振荡孵育4 h. 弃上清,200 μL活化缓冲液清洗Protein A+G beads 2次,加入活化缓冲液400 μL,4 ℃,振荡孵育2 h. 离心,保留少量液体,并定量. 取出 EDAC和 NHSS储备液,室温融化,涡匀. 吸2 μL EDAC和2 μL NHSS加到上述0.6 mL EP管中,补加活化缓冲液至液体终体积100 μL(EDAC终浓度为2 mmol/L,NHSS终浓度为5 mmol/L),涡旋混匀,置于冰上活化1 h. 向上述100 μL溶液中加 200 μL偶联缓冲液,振荡,4 ℃,2 000 rpm离心3 min,重复3次. 加入偶联缓冲液400 μL,4 ℃,振荡孵育2 h. 4 ℃,2 000 rpm离心3 min,保留液体,并定量. 加入3 μL Click-iT® DIBO-amine,补加偶联缓冲液使得溶液的终体积为100 μL,(Click-iT® DIBO-amine终浓度为1.8 mmol/L),轻轻涡旋,4 ℃反应过夜. 交联结束的反应液,加入200 μL DPBS,4 ℃,2 000 rpm离心3 min,弃上清,重复 3次,使Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO 终体积约50 μL.

各取5 μL Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO于PCR管中. 加入1 μL Alexa Fluor® 488 Azide(终浓度约100 μmol/L). 4 ℃,避光反应1 h. 加入200 μL DPBS,4 ℃,2 000 rpm离心3 min,弃上清,重复3次. 取Protein A+G beads置于96孔板中,在荧光显微镜下观察实验现象及采集图像.

1.2.7 制备叠氮化肿瘤抗原

收集CT26.WT结直肠癌细胞,进行计数,按细胞4×106个/mL接种于10 cm培养皿中,取5.825 mL细胞培养基于15 mL离心管中,加入175 μL 20 mmol/L Ac4ManNAz充分混匀(Ac4ManNAz终浓度为0.5 mmol/L),加至10 cm培养皿中,于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h. 次日更换新培养基,即弃掉细胞培养皿中的旧培养基,加7 mL含700 μL 20 mmol/L Ac4ManNAz的细胞培养基(Ac4ManNAz终浓度为2 mmol/L),于37 ℃、5%CO2条件下再培养24 h.

1.2.7.1 N3-TAg与Alexa Fluor® 488 Azide的结合

向培养皿中加终浓度为5 μmol/L的Alexa Fluor® 488 Azide. 室温,避光反应1 h. DPBS清洗细胞3次,荧光显微镜下观察并采集图像.

1.2.7.2 N3-TAg的获得

待细胞密度达90%时,弃培养基,1×PBS清洗细胞2次,加入 1 mL RIPA裂解液和10 μL蛋白酶抑制剂于细胞培养皿中,冰上裂解0.5 h,每隔10 min晃动培养皿一次,收集细胞裂解液于1.5 mL EP管中,4 ℃、12 400 rpm离心11 min,收集上清,加入10倍体积的冰乙醇沉淀N3-TAg,置于-80 ℃冰箱中,静置过夜.

1.2.8 mlgG1Fc-DIBO与N3-TAg的生物正交反应

次日,取出醇沉蛋白N3-TAg,4 ℃、12 500 rpm离心10 min. 弃掉冰乙醇上清,并清洗蛋白沉淀一次,置于冰上,待乙醇挥发干净,每管用100 μL的结合缓冲液复融N3-TAg,将溶于结合缓冲液中的N3-TAg 在高温下变性6 min,立即置于冰上5 min,加入蛋白酶抑制剂,涡旋混匀.

将N3-TAg加入1.2.6步骤的Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO中,涡旋混匀,室温,振荡孵育1 h,用200 μL DPBS清洗Protein A+G beads,4 ℃,2 000 rpm离心3 min,重复3次. 50 μL 1×Loading Buffer重悬Protein A+G beads,99 ℃煮样6 min,4 ℃、12 500 rpm离心3 min,上样,进行免疫印迹检测,由此确定生物正交反应的发生.

1.2.9 免疫印迹

配置15%的上层胶和4%的下层胶,样品与loading buffer 按比例混合,99 ℃煮样6 min,4 ℃、12 500 rpm离心3 min,上样,调电压至85 V电泳约30 min,蛋白Marker分开后,调电压至135 V继续电泳约1 h,直至溴酚蓝散去. 转膜后,在冰浴恒流条件下270 mA电泳1.5 h. 转膜完成后,将PVDF膜浸于封闭液中,室温振荡封闭2 h后,敷一抗,4 ℃恒温振荡孵育12 h,洗膜后加入二抗,室温振荡孵育1.5 h,将显色液加至PVDF膜表面,使用Tanon 5200 Multi多功能成像系统显色并采集图片.

2 结果与讨论

2.1 mlgG1Fc的表达与鉴定

将目的基因mlgG1Fc-linker克隆到pcDNA3.1(+)表达载体上,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker,质粒图谱如图1-A所示. 将构建出的重组表达载体pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker转化大肠杆菌DH5α感受态细菌,质粒小提后送至公司进行测序,同步,进行琼脂糖凝胶电泳检测,由实验结果可知,在6 500 bp左右处有明显的目的条带,如图1-B,构建的重组质粒与设计重组质粒大小吻合,由此说明已成功构建出重组表达载体pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker.

A:重组表达载体pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker图谱;B:pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker的琼脂糖凝胶电泳,M:DL1500 DNA Marker;1:pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker图1 pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker的构建Fig.1 Construction of pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker

用pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker转染CHO-K1细胞,分时段收集细胞培液上清,使用Protein A+G beads负载目的蛋白,通过细胞裂解,分析蛋白表达情况,结果如图2所示,收集的培液上清、使用Protein A+G beads富集后的洗脱液和裂解液中均含有目的条带,分子量约为55 kDa.

pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker转染CHO-K1细胞,分时段(24 h、48 h)收集培液上清,免疫印迹检测培液上清、经Protein A+G beads负载后的培液上清和裂解液中pcDNA3.1(+)-mlgG1Fc-linker的表达.图2 mlgG1Fc的表达Fig.2 Expression of mlgG1Fc

为了鉴定表达收集的mlgG1Fc能否在固相系统中完成DIBO化学标记,首先使用Protein A+G beads负载mlgG1Fc,经活化和偶联,再与Click-iT® DIBO-amine反应,使用Alexa Fluor® 488 Azide荧光检测二者的结合. 实验结果如图3,相对于对照组来说,实验组中可以看到很强的荧光,说明结合有Protein A+G beads的mlgG1Fc成功与Click-iT® DIBO-amine发生化学反应,即证明收集的mlgG1Fc已在固相系统中完成化学修饰.

取两组等量的Protein A+G beads,其中一组Protein A+G beads与mlgG1Fc 4 ℃振荡下孵育4 h,两组Protein A+G beads分别经活化和偶联后,再与Click-iT® DIBO-amine 4 ℃反应过夜. 最后,再与Alexa Fluor® 488 Azide 4 ℃,避光反应1 h. 利用荧光显微镜对比两组实验中的荧光强度.图3 Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO与Alexa Fluor® 488 Azide 的结合Fig.3 The binding of Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO and Alexa Fluor® 488 Azide

2.2 叠氮化肿瘤抗原的制备

经叠氮基团修饰的非天然糖能够通过糖掺入途径进入到肿瘤细胞膜表面的唾液酸化修饰位点,从而获得N3-TAg. 在之前的研究中,已证实使用终浓度为0.5 mmol/L Ac4ManNAz与CT26.WT细胞共培养 24 h,再使用终浓度为2 mmol/L Ac4ManNAz与其共培养24 h,通过裂解细胞可以获得N3-TAg. 利用FITC标记的AIkyne,通过免疫荧光技术考察肿瘤细胞表面叠氮化修饰的情况. 结果如图4所示,实验组有荧光且非常强烈,而对照组没有荧光,这表明Ac4ManNAz能通过细胞糖代谢途径掺入到CT26.WT细胞表面含唾液酸的糖蛋白上,使糖蛋白带上叠氮基团.

将终浓度为0.5 mmol/L Ac4ManNAz与CT26.WT细胞共培养24 h,再用终浓度为2 mmol/L Ac4ManNAz共培养24 h. 利用FITC标记的AIkyne,荧光显微镜观察两组的荧光强度.图4 免疫荧光检测Ac4ManNAz代谢掺入Fig.4 Immunofluorescence detection of Ac4ManNAz metabolic incorporation

2.3 生物正交反应

收集Ac4ManNAz代谢掺入的肿瘤细胞蛋白溶液,与Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO室温振荡孵育1 h,Western blot检测两者结合情况,实验结果如图5所示. 从图中可以看出,A实验组有目的条带,说明N3-TAg与mlgG1Fc-DIBO通过生物正交反应缀合在一起.

将收集的N3-TAg投入到Protein A+G beads-mlgG1Fc-DIBO中,涡旋混匀,室温,振荡孵育1 h,DPBS清洗Protein A+G beads 3次,1×Loading Buffer 重悬Protein A+G beads,99 ℃煮样6 min,4 ℃、12 500 rpm离心3 min,上样,进行免疫印迹检测.图5 N3-TAg与mlgG1Fc-DIBO的生物正交反应Fig.5 Bio-orthogonal reaction of N3-TAg and mlgG1Fc-DIBO

3 结论

随着我国恶性肿瘤发病率逐年上升,在传统疗法收效甚微时,肿瘤免疫治疗为肿瘤患者带来了福音[23-24]. 肿瘤免疫治疗的原理是通过启动机体免疫系统,克服肿瘤免疫逃逸机制,增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力来清除癌细胞,其具有安全性高、耐受性好,极少出现不良反应等特点. 目前,肿瘤免疫治疗是除外科手术、化疗和放疗以外最重要的治疗肿瘤的方法[25-26].

在本课题中,首先利用分子生物学手段成功构建并表达出可以靶向FcγRI的融合蛋白mlgG1Fc. 与此同时,为了解决鉴定新抗原难度大、耗时耗力等瓶颈问题,将广谱全肿瘤抗原通过激活性内吞受体途径递送给APC,从而实现肿瘤抗原的靶向递送,更有利于激发广泛、特异性的抗肿瘤免疫应答. 此外,Ac4ManNAz通过代谢掺入标记CT26.WT结直肠癌细胞抗原的唾液酸修饰位点,封闭修饰在肿瘤抗原糖链上的唾液糖残基,阻止肿瘤抗原通过抑制性途径进入机体,避免肿瘤免疫耐受[27-29]的形成.

为了评价制备出靶向DCs的结直肠癌肿瘤疫苗的疗效,需进行体内和体外实验. 在体外实验中,还需进一步检测不同肿瘤抗原对DCs表型、共刺激分子表达的影响,经抗原致敏后的DCs对淋巴细胞增殖情况以及对小鼠结直肠癌肿瘤细胞的体外杀伤作用. 在体内实验中,还需进一步验证肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的预防和治疗效果. 总而言之,本研究为制备新型结直肠癌肿瘤疫苗提供了新的开发方法和新的理论依据,与此同时,也为下一步体内和体外实验的开展打下了坚实的基础[29].