液相色谱-串联质谱法同时检测鸡肉中61 种抗菌药物

朱效博，武云龙，孙晓亮，王 涛，杨 敏，杨智和，5，王桂琴，赵思俊

（1.宁夏大学，宁夏银川 750021；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山西农业大学，山西晋中 030800；4.青岛市智慧乡村发展服务中心，山东青岛 266200；5.天津农学院，天津 300384）

作为仅次于猪肉的第二大肉类产品，鸡肉是我国居民主要的动物蛋白来源。随着养殖数量的快速增加、养殖规模的快速扩大，各类禽类疫病也随之出现，而用于预防和治疗家禽疫病的抗菌药物误用、滥用情况也不断出现[1]。抗菌药因具有抗菌谱广、高效、低毒、价格低廉、性质稳定等优点，在畜禽养殖过程中得到了大量应用，但也造成了磺胺类、喹诺酮类及大环内酯类等药物在禽类产品中的残留现象[2]，直接危害着人类健康[3]。近年来，细菌耐药性的产生和传递问题也日益受到人们的高度关注[4]。为此，开展禽肉产品中磺胺类、喹诺酮类及大环内酯类等常用抗菌药物残留高通量检测显得尤为迫切。

目前，国内外有关畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类及大环内酯类药物残留的检测方法多是针对某一类药物如磺胺类[3，5]、喹诺酮类[6-7]、大环内酯类[4，8]的单独分析检测。而同时测定此3 大类多种药物的方法较少或能够检测的3 大类药物数量少[9-11]，且前处理方法复杂[12-13]。针对上述3 类药物经常使用的检测方式主要有高效液相色谱[11-12，14]、液相色谱-串联质谱[13，15-16]和免疫检测[17]，其中液相色谱-串联质谱法由于其高灵敏度和高效率的优势已成为药物残留检测应用最广泛的分析技术[18]。禽肉的前处理中常用液-液萃取[1-2]、固相萃取[10，19-20]、QuEChERS 法[15]等净化方式。其中固相萃取具有选择性高、速度快、重复性好等优点，且商品化的固相萃取柱（SPE 柱）类型丰富，能满足各类组分分析，应用范围更广。目前已发表的文献中，分析上述3 大类药物的SPE 柱主要有C18[21-22]、HLB[17]、MCX[5，20]及prime HLB[12]，但相关检测方法的检测限、准确度、稳定性等不尽相同。为此，本研究系统比较了不同固相萃取柱对于鸡肉中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类等3 大类61 种药物同时测定的液相色谱-串联质谱方法。通过比较，经PBS 缓冲液提取，以Agilent Pleax PCX SPE 柱净化，最后以液相色谱-串联质谱进行检测适用于鸡肉中61 种抗菌药物痕量残留的快速检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Acquity UPLC-Xevo TQ MS 超高效液相色谱-串联质谱仪，美国Waters 公司产品；氮吹仪，美国Organomation 公司产品；多管漩涡混合仪，美国Talboys 公司产品；MilliQ 超纯水仪，美国Millipore 公司产品；5804R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司产品；固相萃取装置、PCX 固相萃取柱（60 mg、3 mL），美国Agilent 公司产品。甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck 公司产品；甲酸为色谱纯，购自上海安谱实验科技股份有限公司；PBS 盐包，Solarbio 公司产品；氨水为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；试验用水为超纯水，由MilliQ 纯水仪制得。3 大类61 种药物标准物质，纯度均在95%以上，具体见表1。

1.2 标准溶液配置

分别准确称取61 种抗菌药物标准品于10 mL容量瓶中，用0.03 mol/L 的氢氧化钠溶液溶解并用甲醇定容，配制质量浓度为100 mg/L 的标准储备液，于-20 ℃避光冷冻保存；分别移取适量标准储备液，配制质量浓度为1 mg/L 的61 种抗菌药物的混合标准储备液；分别移取适量混合标准储备液，根据试验需要用甲醇逐级稀释为适当浓度的混合标准工作液。

1.3 其他溶液配置

1.3.1 PBS 缓冲液 将PBS 盐包用纯水溶解并定容至2 L，配制成浓度为0.01 mol/L 的PBS 溶液。

1.3.2 0.2%甲酸-20%甲醇溶液 取20 mL 甲醇于100 mL 容量瓶中，加入200 μL 甲酸，用超纯水定容至刻度。

1.3.3 20% 氨化甲醇溶液 取20 mL 氨水于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.3.4 0.1%甲酸-乙腈溶液 取15 mL 乙腈于100 mL 容量瓶中，加入100 μL 甲酸，用超纯水定容至刻度。

1.4 样品前处理

准确称取2 g 鸡肉于50 mL 离心管中，加入8 mL PBS 缓冲液，涡动振荡5 min，4 ℃ 8 000 r/min离心5 min，然后将上清液转移至另一干净离心管中；按照上述步骤重复提取一次，合并两次上清并混匀，重复离心1 次，取上清，用甲酸调节pH=3；将4 mL 提取液加入经3 mL 甲醇、3 mL 纯水活化的PCX 固相萃取柱，分别用3 mL 0.2%甲酸水、3 mL 0.2%甲酸-20%甲醇溶液淋洗，真空泵抽干；用3 mL 20%氨化甲醇溶液洗脱，在40～50 ℃水浴条件下以氮气吹至近干，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液复溶，涡动振荡1 min，经0.22 μm 针式滤膜过滤，待测。

1.5 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：乙腈。流速为0.3 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为5 μL。梯度洗脱条件见表2。

表2 梯度洗脱时间表

1.6 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，采用多反应监测（MRM）模式。毛细管电压2 800 V，离子源温度150 ℃，雾化室温度450 ℃；去溶剂气（氮气）流量1 000 L/h，锥孔气（氮气）流量50 L/h，碰撞气（氩气）流量0.24 L/h。各化合物母离子、定性/定量离子对及碰撞能量、锥孔电压等质谱检测参数见表3。

表3 定性/定量离子对及对应锥孔电压和碰撞能量、保留时间

表3 定性/定量离子对及对应锥孔电压和碰撞能量、保留时间（续）

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

准确量取2 g 空白样品，分别按照定量限和最大残留限量（MRL）进行加标回收试验，按照1.4前处理方法对样品进行处理后上机检测。每个水平做6 个平行试验，进行3 次批间重复，使用基质标准曲线进行校正。由表4 可见，61 种药物的平均回收率为62.9%～118.2%，批内相对标准偏差（RSD）为1.3%～17.9%，批间RSD 为4.3%～18.8%。

表4 药物添加量、回收率、批内和批间RSD

表4 药物添加量、回收率、批内和批间RSD（续）

2.2 提取条件选择

目前已经发表的文献中对于喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类药物常用的提取液主要有磷酸盐缓冲溶液[21，23-24]、乙腈[22，25]、甲酸乙腈[13]、乙酸乙腈[26]。通过试验对不同提取液提取效果的系统比较结果（图1）显示：使用乙腈、0.2%甲酸-乙腈提取时，喹诺酮类药物回收率很低，只有30.0%～60.0%，而且需要将乙腈吹至近干后复溶才能进行净化，因而增加了前处理的步骤和时间；使用不同浓度的磷酸二氢钾溶液提取时，3 类药物的回收率均略低于PBS 缓冲液；使用PBS 缓冲液（pH=7）作为提取液，磺胺类药物回收率为68.8%～104.5%，喹诺酮类药物回收率为67.0%～99.1%，大环内酯类药物回收率为63.0%～93.7%，提取效率明显优于有机溶剂，提取速度也更快。

2.3 净化条件选择

2.3.1 SPE 柱比较与选择 分别考察了Waters Oasis HLB（以下简称W-HLB）、Agilent Pleax PCX（以下简称A-PCX）、CNW Poly-Sery MCX（以下简称C-MCX）和Waters Oasis MCX（以下简称W-MCX）4 种阳离子交换SPE 柱。通过试验对不同SPE 柱分别进行准确度与精密度测试。结果显示：W-HLB 柱平均回收率为43.6%～104.1%，批内RSD 为1.4%～16.2%，批间RSD 为3.6%～19.2%；C-MCX 柱平均回收率为27.3%～104.0%，批内RSD 为1.8%～16.6%，批间RSD 为2.1%～19.7%；W-MCX 柱平均回收率为42.7%～99.4%，批内RSD 为2.3%～18.3%，批间RSD 为1.8%～18.9%；A-PCX 柱平均回收率为62.9%～118.2%，批内RSD为1.3%～17.9%，批间RSD 为4.3%～18.8%。此外，W-HLB 柱药物整体回收率低于其余3 种阳离子交换柱（图2～3），且提取液过柱流速更慢，需要的分析时间更长[22]。另外，在同等试验条件下，W-MCX 柱的基质效应高于A-PCX 柱和C-MCX柱；使用C-MCX 柱时，林可霉素、红霉素、吉他霉素、阿奇霉素等4 种大环内酯类药物回收率低于A-PCX 柱（图4）。综合上述比较，最终选择用A-PCX 柱净化处理。

2.3.2 淋洗条件优化 据文献报道，使用阳离子交换柱净化磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类药物时，常采用纯水[5]、0.1 mol/L 盐酸水[26]或甲醇淋洗[20]。本试验通过正交试验法系统比较了纯水、0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、0.3%甲酸水、1%甲酸水，20%甲醇、0.1%甲酸-20%甲醇、0.2%甲酸-20%甲醇、0.3%甲酸-20%甲醇、1%甲酸-20%甲醇、甲醇分别作为淋洗液时的净化情况。结果显示：当使用甲醇淋洗时，氟甲喹、萘啶酸、恶喹酸、西诺沙星、林可霉素和所有磺胺类药物均被洗掉70%以上；当纯水和20%甲醇水溶液中甲酸含量小于0.2%时，磺胺醋酰、磺胺米隆、林可霉素、西诺沙星能被洗掉20%左右。因此，最终选择用0.2%甲酸水和0.2%甲酸-20%甲醇作为淋洗液。

2.3.3 洗脱条件优化 据文献[5，20]报道，使用阳离子交换柱常用5%氨化甲醇作为洗脱液，回收率在80%以上。本试验比较了5%、10%、15%、20%氨化甲醇对上述3 类药物的洗脱情况。结果显示：4 种洗脱液对磺胺类、大环内酯类药物和氟罗沙星、吡咯酸、氟甲喹、萘啶酸、恩诺沙星、奥比沙星、恶喹酸沙星、沙拉沙星、二氟沙星等均能洗脱，回收率在60%以上；但使用5%、10%、15%氨化甲醇时，依诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、帕珠沙星、那氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、克林沙星、莫西沙星，司帕沙星、妥舒沙星、西他沙星、洛美沙星，回收率仅有15%～55%；使用20%氨化甲醇时，所有药物回收率均可达62%以上。因此，选择20%氨化甲醇作为洗脱液。不同洗脱液对喹诺酮类药物回收率对比见图5。

3 结论

本试验使用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法测定禽肉中3 大类61 种兽用抗菌药物，并对前处理条件进行优化，使用具有高选择性、高灵敏度的固相萃取进行样品净化，考察了不同SPE 柱对样品的净化效果，最终确定用PBS 磷酸盐缓冲液提取，A-PCX 柱净化，液相色谱-串联质谱法检测。该方法简单、快速，涉及的抗菌药物种类及数量多，且具有良好的准确度及精密度，可用于鸡肉样品中磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物的残留检测。