Midkine对神经母细胞瘤TNB1细胞生长与分化的影响*

朱琳 陈潞萍 牟萍

神经母细胞瘤是一种发生在外周交感神经系统的小儿恶性肿瘤，90%的神经母细胞瘤患者发病于10岁之前，且恶性度高，约占儿童肿瘤致死率的15%[1]。早期的研究发现，中期因子（midkine，MK）在神经母细胞瘤患者肿瘤组织中高表达[2]，而且在神经母细胞瘤患者血清中MK的含量显著高于正常组[3]。MK是一种肝素结合生长因子，在胚胎期高表达，成年后其表达量处于较低水平[4]。在肿瘤研究方面发现MK表达与多种癌症发生相关，在非小细胞肺癌[5]、黑色素瘤[6]、肠癌[7]、肝癌[8]、胃癌[9]、食管鳞状细胞癌[10]、间皮瘤[11]以及神经母细胞瘤[3]等多种肿瘤患者血清中发现MK的含量显著增加。同时，研究发现在非小细胞肺癌中MK通过调节Notch-NF-κB通路，增强细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促进肿瘤发展[12]。在其他肿瘤中，MK的表达与肿瘤细胞的生长和转移也有密切的关系，如在神经胶质瘤中，MK通过诱导生成生长因子CCL5，进而促进神经胶质瘤细胞的生长[13]；在前列腺癌干细胞中，敲减MK可以引起细胞在S期以及G2/M期发生细胞周期阻滞[14]；在黑色素瘤中，MK通过mTOR通路促进肿瘤转移[15]。目前，虽然MK在多种肿瘤中的生物学作用被发现，然而关于其在神经母细胞瘤发生发展中的作用及其机制未被完全阐明。

本研究通过分析神经母细胞瘤临床患者数据库信息，对相关的细胞及动物实验进行验证，以期明确MK对神经母细胞瘤TNB1细胞生长及分化能力的影响以及作用机制，旨在揭示MK在神经母细胞瘤发生发展中的意义，为神经母细胞瘤的临床治疗提供新的治疗靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640培养液、DMEM培养液、MK shRNAs（MK shRNA-1编码序列：5’-CCGGCGACTGCAAGTACAAGTTTGA CTCGAGTCAAACTTGTACTTGCAGTCGTTTTTG-3’；MK shRNA-2 编码序列：5’-CCGGCAAGACCAAAGC AAAGGCCAACTCGAGTTGGCCTTTGCTTTGGTCT TGTTTTTG-3’）、肾细胞癌下调蛋白1（downregulated in renal carcinoma 1，DRR1）shRNAs（DRR1 shRNA-1编码序列：5’-CCGGCAAGAAGAAGAAGGAGGAG CTCTCGAGAGCTCCTCCTTCTTCTTCTTGTTTTTT G-3’；DRR1 shRNA-2 编码序列：5’-CGGCCTAGTCT TATGGAAAGCAAACTCGAGTTTGCTTTCCATAAG ACTAGGTTTTTTG-3’）以 及control shRNA（美国Sigma公司），病毒包装载体psPAX2和pMD2.G（美国Addgene公司），脂质体Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），ISOGEN裂解液、逆转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），基质胶（美国BD Biosciences公司）。7 500型荧光定量PCR仪购于美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 临床数据来源及分析 使用R2（http://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi）临床患者数据库中的Kocak-649-custom-ag44kcwolf数据库（n=476）及Jagannathan-100-custom ilmnhwg6v2数据库（n=100）进行分析。在统计神经母细胞瘤患者生存率时，利用Kocak-649-custom-ag44kcwolf数据库中476例患者的相关数据，通过使用卡普兰扫描的分析方法，可直接将所有样品分成MK或者DRR1的高表达组或低表达组，并使用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。

1.2.2 细胞培养以及慢病毒感染 人神经母细胞瘤TNB1细胞培养于含有10% FBS的RPMI-1 640培养液中。293T细胞培养于含有10% FBS的DMEM培养液中。上述细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养，根据各细胞的生长情况采用0.25%胰蛋白酶消化进行传代。

293T细胞中包装所得慢病毒进行滴度测定，按照感染复数（multiplicity of infection，MOL）为5，按比例将慢病毒与Polybrene穿孔素（浓度1 μg/mL）共同加入TNB1细胞进行细胞感染实验，24 h后换液并加入嘌呤霉素（浓度1 μg/mL）进行感染细胞的筛选。

1.2.3 RNA提取、逆转录和Real-time PCR 先用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次，然后使用ISOGEN裂解液按照说明书操作步骤从细胞中提取总RNA并测定RNA浓度。取1 μg RNA通过逆转录反应获得cDNA。各取2 μL cDNA样品，利用SYBR Green试剂盒以GAPDH作为内参进行Real-time PCR反应。PCR反应条件：95℃ 3 min；95℃ 30 s；56℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。引物序列：人MK上游引物为5’-C GCGGTCGCCAAAAAGAAAG-3’，下游引物为5’-T ACTTGCAGTCGGCTCCAAAC-3’；人DRR1上游引物为5’-GAATACAGAGAGTGGAATCCGGAGCTCA TC-3’，下游引物为5’-GCTTGGCTTCCAGCTCCTCCT TCTTCTTCT-3’；人酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）上游引物为5’-GAGGAAATTGAGAAGCT GTCC-3’，下游引物为5’-CAGACACGAAGTAGACT GAC-3’；人生长相关蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）上游引物为5’-AGTGAGCAAGCG AGCAGAA-3’，下游引物为5’-GTTGCGGCCTTATG AGCTT-3’；人GAPDH上游引物为5’-ATCATCCCT GCCTCTACTGG-3’，下游引物为5’-CCCTCCGACGCC TGCTTCAC-3’。

1.2.4 软琼脂克隆形成实验 将1.5 mL的下层琼脂（0.5%琼脂/RPMI-1640+10% FBS）铺入6孔板的底部，待凝固后铺入1 mL含有2 000个TNB1细胞的上层琼脂（0.33%琼脂/RPMI-1640+10% FBS），上层琼脂凝固后将6孔盘置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后在上层琼脂上方加入1 mL无血清RPMI-1640培养基。2周后，使用结晶紫染色20 min，显微镜下拍照并进行计数。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。所有数据结果使用±s 表示，临床数据采用对数秩检验分析，其余组间差异使用t检验分析。以P＜0.05为差异具有统计学差异。

2 结果

2.1 MK表达量与神经母细胞瘤患者生存率的关系

通过分析神经母细胞瘤临床数据发现（Kocak-649-custom-ag44kcwolf数据库，n=476），MK表达量与神经母细胞瘤患者生存率呈负相关。MK高表达患者（n=325）的生存率显著低于MK低表达患者（n=151）的生存率（P＜0.01，图1A）。

图1 MK调节TNB1细胞的生长与分化

2.2 MK调节TNB1细胞的生长与分化

为了进一步分析MK在神经母细胞瘤中的作用，本实验分为对照组（Con. shRNA）和MK shRNA组（MK shRNA-1、MK shRNA-2）。实验利用含有Con.shRNA和MK shRNA的慢病毒分别感染TNB1细胞并在低血清（2% FBS）状态下培养2 d。在显微镜下进行拍照后，使用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞进行细胞计数。结果显示，MK shRNA组的TNB1细胞数量较对照组明显减少（P＜0.01，图1B），同时MK shRNA组的TNB1细胞突起变长，呈现分化趋势（图1C）。为了确认细胞的分化状态，进一步利用Real-time PCR分析了神经母细胞瘤细胞分化标志物TH以及GAP43的表达水平，结果显示MK shRNA组的TNB1细胞中TH（P＜0.01，图1E）以及GAP43（P＜0.01，图1F）的表达量显著高于对照组。

2.3 MK调节DRR1在TNB1细胞中的表达

为了研究MK在神经母细胞瘤中的作用机制，进一步从神经母细胞瘤临床患者数据库（Kocak-649-custom-ag44kcwolf数据库）中筛选了与MK表达相关的基因，发现DRR1的表达量与MK呈负相关（P＜0.01，图2A）。该结果在另一个神经母细胞瘤临床患者数据库（Jagannathan-100-custom ilmnhwg6v2数据库）中也得到了验证（P＜0.01，图2B）。同时，利用MK shRNA慢病毒感染TNB1细胞，采用Real-time PCR对DRR1的表达水平进行测定。结果显示，与对照组相比，MK shRNA组细胞的DRR1表达量显著增高（P＜0.01，图2C）。神经母细胞瘤临床患者数据库（Kocak-649-custom-ag44kcwolf数据库，n=476）的分析结果显示，DRR1表达量与神经母细胞瘤患者生存率呈正相关，DRR1高表达组患者（n=362）的生存率显著高于DRR1低表达组患者（n=114）的生存率（P＜0.01，图2D）。随后，利用携带DRR1 shRNA的慢病毒感染TNB1细胞，并分析细胞生长以及分化情况。本实验分为对照组（Con. shRNA）和DRR1 shRNA组（DRR1 shRNA-1、DRR1 shRNA-2）。结 果显示，DRR1 shRNA组的TNB1细胞数量较对照组增加，同时细胞突起较对照组缩短（图2E）。

图2 MK调节TNB1细胞中DRR1的表达

2.4 下调DRR1表达对于MK敲减后TNB1细胞分化和软琼脂克隆形成的影响

为了验证MK是否通过调节DRR1表达，从而参与调节TNB1细胞生长以及分化，本实验利用携带MK shRNA与DRR1 shRNA的2种慢病毒感染的TNB1细胞，2 d后分析细胞的生长与分化情况。本实验分为对照组（Con. shRNA）、MK shRNA-1组和MK shRNA-1+DRR1 shRNA-1组。结果显示，MK shRNA-1+DRR1 shRNA-1组的细胞突起较MK shRNA-1组变短（图3A），并且分化标志物TH（P＜0.01，图3B）以及GAP43（P＜0.01，图3C）的表达量显著低于MK shRNA-1组。软琼脂克隆形成实验结果显示，MK shRNA-1+DRR1 shRNA-1组的细胞克隆数量显著高于MK shRNA-1处理组（P＜0.01，图4）。

图3 下调DRR1表达对于MK shRNA对TNB1细胞分化的影响（n=3）

图4 下调DRR1表达对于干扰MK shRNA对TNB1细胞克隆形成的影响（n=3）

3 讨论

近年来，MK表达在多种肿瘤中被发现，其作用及相关分子机制逐渐被证实，然而在神经母细胞瘤中的作用尚未阐明。在影响肿瘤细胞分化方面，有研究报道MK的表达与食管鳞状细胞癌的分化不良紧密相关[16]，但关于MK在神经母细胞瘤分化中的作用鲜见报道。本研究发现，MK表达水平的改变能够影响神经母细胞瘤TNB1细胞的分化。通过深入分析神经母细胞瘤临床患者数据库信息发现，在神经母细胞瘤中，MK与DRR1表达呈负相关，进一步的实验研究表明，MK可以通过调节DRR1的表达进而调控TNB1细胞的生长与分化，该研究结果为神经母细胞瘤发生发展的分子机制提供了新的理论基础。

DRR1因其在肾细胞癌[17]、非小细胞肺癌[18]、肝癌[19]、纤维肉瘤[20]、星形细胞瘤[21]以及神经母细胞瘤[22]等多种肿瘤中表达量降低，被定义为肿瘤抑制因子。本课题组前期研究发现，在神经母细胞瘤细胞中过表达DRR1可下调Cyclin D1表达，导致细胞在G1/S期发生细胞周期阻滞，进而抑制神经母细胞瘤的增殖[22]。有研究发现，上调MK的表达可增加Cyclin D1表达[23-24]，并促进细胞周期由G1期向S期进行转换[25]。有研究证实，Cyclin D1与细胞分化相关，下调Cyclin D1表达可以促进急性早幼粒细胞性白血病细胞分化[26-27]，且一些研究结果证明Cyclin D1的表达与细胞生长呈正相关[28-30]。本研究发现，下调MK表达可以抑制神经母细胞瘤的细胞生长，促进细胞分化，而DRR1的表达下调可以挽救由MK敲减引起的生长抑制以及促分化作用。以上结果提示，MK可能通过调节DRR1的表达，进而影响Cyclin D1的表达以及细胞G1/S期转换，最终影响神经母细胞瘤的生长与分化。在后续研究中，本研究组将深入研究MK调节DRR1表达的分子机制，进一步揭示MK-DRR1-Cyclin D1轴在神经母细胞瘤中的作用。

综上所述，在神经母细胞瘤中MK的表达量与患者生存率呈负相关，而其下游因子DRR1的表达量与患者生存率呈正相关。MK对DRR1呈负向调控作用，敲减MK将促进DRR1的表达，进而抑制TNB1细胞生长以及促进细胞分化。本研究结果揭示了MK调控神经母细胞瘤生长以及分化的相关分子机制，为临床神经母细胞瘤的治疗提供新的治疗靶点和理论支持。