LncRNA UNC5B-AS1靶向miR-339-5p调控人肺腺癌细胞系A549增殖和凋亡

张 健，张吉炯

(黄石市中心医院 呼吸内科, 湖北 黄石 435000)

肺癌(lung cancer)起源于气管、支气管黏膜或腺体，是一种恶性肿瘤。根据组织病理学特点不同，可分为非小细胞癌和小细胞癌。全球范围内，肺癌的发病率、病死率都极高且呈上升趋势[1]。LncRNA是一类真核生物中长度大于200 nt的非编码RNA分子，它具有多种生物学功能，在一系列疾病都发现了lncRNA表达异常，比如神经退行性疾病、心血管疾病、肾脏疾病、糖尿病和肿瘤等[2]。miRNAs(microRNAs)是一类长度约19～24 nt的非编码单链RNA，广泛存在于动物、植物、真菌及病毒的基因组中，调控生物体生长发育和疾病发生等过程中相关基因的表达[3]。有研究表明，lncRNA可通过调控miRNA的表达从而影响细胞生物学行为[4]。但是lncRNA UNC5B-AS1能否通过靶向miR-339-5p调控肺癌的发生发展尚未可知。本研究旨在研究lncRNA UNC5B-AS1靶向miR-339-5p对肺癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

组织来源：收集2018年3月至2019年1月到黄石市中心医院呼吸内科进行治疗的30例肺癌患者作为研究对象，其中男13例，女17例，年龄40～70岁，术中收集患者肺癌组织及癌旁组织，备用。此研究经黄石市中心医院伦理委员会批准(伦理审批号：20180123)，并取得所有家属及患者的知情同意。

人肺腺癌细胞系A549(中国科学院上海细胞库)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(Invitogen公司)；胰蛋白酶(上海生工生物工程公司)；Lipofectamine 2000(北京天根生化科技公司)；Trizol试剂、反转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(大连TaKaRa生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(CST公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、增强型化学发光试剂(ECL)(Sigma-Aldrich公司)；Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax抗体(Abcam公司)；二抗(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：取对数期A549细胞，胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，按2×105个细胞/孔接种于6孔板，细胞汇合度至70%时进行转染，按照Lipofectamine 2000将si-NC、si-UNC5B-AS1、miR-NC、miR-339-5p mimics转染至A549细胞中，培养48 h，si-UNC5B-AS1与anti-miR-NC、si-UNC5B-AS1与anti-miR-339-5p共转染至A549细胞中，培养48 h，分别作为si-NC组、si-UNC5B-AS1组、miR-NC组、miR-339-5p组、si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC组、si-UNC5B-AS1+anti-miR-339-5p组。收集细胞，进行后续实验。

1.2.2 RT-qPCR 检测细胞UNC5B-AS1和miR-339-5p表达：Trizol试剂提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，采用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行荧光定量，反应条件：95 ℃ 2 min(循环1次)，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(循环40次)。UNC5B-AS1：上游引物5′-TCGCTACATCCA CTCTCACC-3′，下游引物 5′-CTTCCAGATCCCACCA CAGT-3′；miR-339-5p：上游引物5′-GGGTCCCT GTCCTCCA-3′，下游引物 5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；GAPDH：上游引物5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTC AAC-3′，下游引物：5′-GGGGTCATTGATGGCAACAA TA-3′；U6：上游引物5′-AAAGCAAATCATCGGACG ACC-3′，下游引物5′-GTACAACACATTGTTTCCTCG GA-3′。2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖：将A549细胞按照5×103个/孔接种到96孔板，每个孔10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养箱孵育2 h，之后用酶标仪在490 nm的波长处检测吸光度(A)值。

1.2.4 流式细胞测量术检测细胞凋亡：取1.0×106个细胞，PBS清洗细胞2次，加入500 μL结合缓冲液。分别向流式管中加入5 μL annexin V-FITC和5 μL PI染液，室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验：利用LncBase Experimental v.2生物信息学软件预测UNC5B-AS1与miR-204-3p的结合位点。分别构建野生型载体UNC5B-AS1-WT与突变型载体UNC5B-AS1-MUT，将载体共转染至A549细胞中，培养48 h，根据荧光素酶报告检测试剂盒计算细胞相对荧光素酶活性。

1.2.6 Western blot检测cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达：收集A549细胞，提取细胞总蛋白，BCA检测蛋白浓度，水浴加热变性。分离蛋白、转膜，封闭，加入一抗稀释液(1∶1 000)，4 ℃过夜孵育，加入二抗稀释液(1∶2 000)，室温孵育1 h，滴加ECL显影，ImageJ软件分析各条带吸光度(A)值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 癌旁组织和肺癌组织中UNC5B-AS1和miR-339-5p的表达

与癌旁组织比较，肺癌组织中UNC5B-AS1表达水平显著升高(P<0.05)，miR-339-5p表达水平显著降低(P<0.05)(表1)。

表1 癌旁组织和肺癌组织中UNC5B-AS1和miR-339-5p的表达

2.2 干扰UNC5B-AS1表达对A549细胞增殖和蛋白表达的影响

与si-NC组比较，si-UNC5B-AS1组细胞UNC5B-AS1表达水平显著降低(P<0.05)；细胞活力在24、48和72 h的A值和cyclin D1蛋白表达显著降低(P<0.05)，p21蛋白表达显著升高(P<0.05)(图1,表2)。

表2 干扰UNC5B-AS1表达对A549细胞增殖和蛋白表达的影响

*P<0.05 compared with si-NC group

2.3 干扰UNC5B-AS1表达对A549细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响

与si-NC组比较，si-UNC5B-AS1组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；细胞中Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)(图2，表3)。

表3 干扰UNC5B-AS1表达对肺癌A549细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响

A.apoptosis-related protein expression diagram; B.apoptosis flow cytometry diagram; 0.05 compared with si-NC group

2.4 miR-339-5p过表达对A549细胞增殖及细胞周期蛋白的影响

与miR-NC组比较，miR-339-5p组细胞miR-339-5p表达水平显著升高(P<0.05)；细胞活力在24、48和72 h的A值和cyclin D1蛋白表达显著降低(P<0.05)，p21蛋白表达显著升高(P<0.05)(图3，表4)。

表4 miR-339-5p过表达对A549细胞增殖及细胞周期蛋白的影响

0.05 compared with miR-NC group

2.5 miR-339-5p过表达对A549细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响

与miR-NC组比较，miR-339-5p组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；细胞中Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)(图4，表5)。

表5 miR-339-5p过表达对A549细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响

<0.05 compared with miR-NC group

2.6 UNC5B-AS1靶向调控miR-339-5p的表达

UNC5B-AS1与miR-339-5p的结合位点(图5)。结果显示，野生型载体UNC5B-AS1-WT细胞中，miR-339-5p组荧光素酶活性显著低于miR-NC组(P<0.05)(表6)。

表6 双荧光素酶报告基因实验

图5 UNC5B-AS1与miR-339-5p结合位点

2.7 抑制miR-339-5p表达逆转了干扰UNC5B-AS1表达对A549细胞增殖和凋亡的影响

与(si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC)组比较，(si-UNC5B-AS1+anti-miR-339-5p)组细胞活力在24、48和72 h的A值、cyclin D1蛋白、Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)；细胞凋亡率显著、p21蛋白、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)(图6，表7)。

表7 抑制miR-339-5p表达逆转了干扰UNC5B-AS1表达对A549细胞增殖和凋亡的影响

0.05 compared with si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC group

3 讨论

肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤,发病率和病死率增长最快。据报道近50年来，男性肺癌发病率和病死率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性占第二位[5]。LncRNA可以通过靶向miRNA影响肺癌的发生发展。

本实验研究显示，与癌旁组织比较，肺癌组织中UNC5B-AS1表达水平显著升高，miR-339-5p表达水平显著降低。有文献报道结论与本实验结果研究一致。LncRNA UNC5B-AS1在甲状腺乳头状癌中表达上调，促进了甲状腺癌的发生发展[6]；LncRNA UNC5B-AS1在卵巢癌组织中呈高表达，促进了卵巢癌细胞增殖[7]，miR-339-5p在弥漫大B细胞淋巴瘤中呈低表达，过表达miR-339-5p能够抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭[8]。

本实验研究表明，与si-NC组比较，抑制UNC5B-AS1表达细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高。已有研究发现，lncRNA UNC5B-AS1在结肠癌样本中表达上调，下调lncRNA UNC5B-AS1表达，可抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭[9]。抑制甲状腺癌细胞中lncRNA UNC5B-AS1表达，可促进结肠癌细胞凋亡[10]。说明抑制lncRNA UNC5B-AS1表达可以抑制肺癌细胞的增殖，促进凋亡。

本实验研究发现，与miR-NC组比较，miR-339-5p过表达细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高。已有研究表明，上调miR-339-5p的表达可显著促进胃癌细胞凋亡，并抑制细胞增殖[11]。miR-339靶向ZNF689可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭[12]。miR-339-5p在肺癌细胞中的表达水平显著低于正常水平[13]。说明上调miR-339-5p表达可以抑制肺癌细胞的增殖，促进凋亡。

本实验发现，与si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC组比较，si-UNC5B-AS1+anti-miR-339-5p组细胞活力显著升高；细胞凋亡率显著降低。有相似的研究表明，lncRNA MIR17HG通过上调miR-142-3p而抑制非小细胞肺癌增殖[14]。LncRNA SNHG16通过调节miR-520a-3p/EphA2轴促进非小细胞肺癌的发生发展，为非小细胞肺癌的发病机制和治疗提供了新的靶点[15]。说明干扰UNC5B-AS1通过上调miR-339-5p表达促进肺癌细胞凋亡、抑制细胞增殖。

综上所述，干扰UNC5B-AS1通过上调miR-339-5p表达促进肺腺癌细胞系A549凋亡、抑制细胞增殖。为治疗肺癌提供提供了新的靶点。