miR-188调控TGF-α抑制骨肉瘤细胞增殖与迁移

刘 伟，刘晓峰，赵宝辉

(河北大学附属医院 骨科，河北 保定 071000)

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)[1-2]是一种来源于间充质组织常见的恶性骨肿瘤，目前治疗主要为手术联合化疗[3]，但其复发或转移患者的预后仍很差，因此，迫切需要开发新的骨肉瘤治疗靶点。TGF-α是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的配体，其与多种癌有关。在骨肉瘤组织中，TGF-α表达异常上调，并参与调节骨肉瘤细胞增殖[4-5]，这表明TGF-α是一个对骨肉瘤生长及转移起关键作用癌基因。miRNA(microRNA)是一类内源性ncRNA(non-coding RNA)，通过其转录后调节靶基因表达。已经证明骨肉瘤与多种miRNA相关，miRNA-708在骨肉瘤细胞中表达降低，并通过调控CUL4B参与骨肉瘤细胞的增殖和凋亡[6]；癌相关成纤维细胞外泌体miR-1228能够通过靶向SCAI促进骨肉瘤的侵袭和迁移[7]。本研究前期已预测癌基因TGF-α有可能是miR-188潜在靶基因。虽已经证实多种miRNA参与骨肉瘤的发展，但有关于miR-188暂无报道，本研究旨在观察miR-188在骨肉瘤组织中的表达及其对TGF-α的调节功能和对骨肉瘤细胞增殖及迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本、细胞和裸鼠：收集2018年5月至2020年5月于河北大学附属医院就诊的经手术切除的112例骨肉瘤手术患者肿瘤标本及配对癌旁组织，所有术前均未进行化学治疗，本研究获得河北大学附属医院伦理委员会批准(HDFY-LL-2021-016)且所有患者均已签署知情同意书。人骨肉瘤细胞系MG-63(中国科学院上海生命科学院细胞资源中心);BALB/c-nu小鼠(5～7周龄，雄性，体质量15～19 g)，饲养于河北大学基础医学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂：DMEM培养基(Hyclone公司)；PCR相关试剂、引物、检测试剂盒和核蛋白提取试剂盒(Invitrogen公司)；荧光素酶试剂盒、荧光素酶载体和荧光素酶(Promega公司)；miR-188 mimic、miR-188抑制物和miR-NC(广州锐博生物科技有限公司)；Western blot检测试剂盒(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：在含有10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养MG63细胞。将MG63细胞分为阴性对照组(NC组)，miR-188组，TGF-α组，miR-188+TGF-α组；NC 抑制剂组，TGF-α siRNA组，miR-188抑制剂组，miR-188抑制剂+TGF-α siRNA组，转染前24 h，接种到6孔板，待细胞增殖汇合度至70%～90%时，按照转染试剂LipofectamineTM2000 试剂说明书进行操作。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-188的mRNA表达：使用Trizol从各组细胞中提取总RNA，按照RT-qPCR试剂盒说明书进行操作，U6作为miR-188的表达内参，GAPDH作为TGFA的mRNA内参。

1.2.3 Western blot检测TGF-α的表达：提取组织蛋白，测定蛋白浓度，于12% SDS-PAGE分离蛋白后进行转膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭。加入TGF-α抗体，4 ℃孵育过夜。洗膜后加入相应二抗，ECL液暗室发光显影和定影。

1.2.4 数据库预测：使用TargetScan数据库预测miR-188和TGF-α的结合位点(http://www.target scan.org/vert_71/)。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性：通过TargetScan发现miR-188在TGFA3′-UTR上的潜在结合位点，构建TGFA野生型3′-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-TGFA-Wt和突变型报告基因质粒pMIR-TGFA-Mut，将野生型或突变型报告基因质粒与miR-NC，miR-188 mimic，NC-抑制剂或miR-188抑制剂共转染进MG63细胞。转染24 h后，使用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.6 免疫组化检测Ki-67和TGF-α的表达：组织切片置于65 ℃烤片，而后依次梯度脱蜡、水化、梯度脱蜡和水化。将切片置于柠檬酸盐抗原修复液中，进行抗原修复。加入5%的正常羊血清封闭15 min。加入TGF-α抗体 或Ki-67抗体，4 ℃过夜。加入二抗，37 ℃孵育30 min。采用DAB显色后，苏木精室温染色2 min，进行脱水和中性树脂封片，置于显微镜观察切片。

1.2.7 细胞划痕实验检测MG63细胞的迁移能力：将MG63细胞接种于6孔板上，当细胞汇合度达到80%～90%时，用200 μL的移液器枪头在正中位置划一直线，形成单层细胞间的划痕。利用PBS液将脱落的细胞冲洗掉。显微镜下观察并拍照。

1.2.8 构建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型：将裸鼠随机分为miR-NC组，miR-188 mimic组，NC抑制剂组和miR-188抑制剂组，每组n=6。MG63细胞转染后，调整细胞浓度为5×107个/mL，用1 mL注射器将细胞悬液注射到裸鼠的右后肢腋部皮下，每只裸鼠接种细胞数为1×107个。注射后的裸鼠置于SPF级动物实验室饲养，3周后处死裸鼠，剥取肿瘤，称重。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-188在骨肉瘤组织中表达变化和靶基因预测

相比癌旁组织，骨肉瘤组织中miR-188的表达明显降低(图1A)，miR-188在TGFA的3′-UTR上具有潜在的结合位点及茎环结构(图1B)，转染miR-188mimic明显上调了MG63细胞中miR-188的表达，而miR-188 抑制剂则导致miR-188的表达明显降低(图1C)，pMIR-TGFA-Wt质粒与miR-188 mimic共转染进MG63细胞时，荧光素酶活性明显降低。而转染miR-188抑制剂则能明显增强pMIR-TGFA-Wt质粒的荧光素酶活性(图1D)。

A.expression of miR-188 in osteosarcoma and adjacent normal tissues were detected by RT-qPCR；B.targetscan predicted the potential binding site and stem loop structure of miR-188 on the 3′-UTR of TGFA；C.expression of miR-188 in MG63 cells was detected by RT-qPCR；D.luciferase activity was detected by double luciferase reporter gene assay in MG63 cells；*P<0.01 compared with control group

2.2 miR-188和TGF-α对MG63细胞迁移的影响

miR-188组细胞的迁移能力被抑制，而TGF-α组细胞迁移能力升高，miR-188+TGF-α组MG63细胞迁移能力较miR-188组明显增强(图 2A)；miR-188抑制剂较对照组细胞的迁移能力增加，miR-188抑制剂+TGF-α siRNA组较miR-188 抑制剂增殖能力降低(图 2B)。

A.effects of mir-188 and TGF-α on the migration of MG63 cells；B.effects of miR-188 inhibitor and interfering TGF-α on MG63 cell migration；scale bar=25 μm；*P<0.01 compared with control group

2.3 miR-188在骨肉瘤裸鼠移植瘤模型中的作用

miR-188mimic组裸鼠中Ki-67的表达明显低于对照组，而miR-188抑制剂组中Ki-67的表达则明显升高(图 3)。

*P<0.01 compared with control group; scale bar=50 μm

2.4 在骨肉瘤裸鼠移植瘤模型中TGF-α的表达

TGF-α蛋白在骨肉瘤组织中的表达明显升高(图 4A，C)，RT-qPCR检测骨肉瘤组织中TGF-α的mRNA表达，结果相同(图 4B)。

A.expression of TGF-α in osteosarcoma tissues and adjacent normal tissues were detected by Immunohistochemistry; scale bar=50 μm；B.mRNA expression of TGF-α was detected by RT-qPCR; C.protein expression of TGF-α was detected by Western blot；*P<0.01 compared with normal group

3 讨论

骨肉瘤侵袭性强，恶性程度高，5年生存率很低[8-9]，揭示骨肉瘤致病因子和相关信号通路，对骨肉瘤进一步诊断和治疗至关重要。已证实miR-188在多种癌发挥抑癌作用。miR-188在胶质瘤组织和细胞系中的表达明显下调，miR-188通过靶向β-catenin来抑制胶质瘤细胞的增殖[10]；通过表达miR-188-5p可以明显抑制胃癌细胞的增殖和侵袭并抑制体内肿瘤生长[11]；在乳腺癌细胞研究中发现过表达miR-188能够抑制4T1和MCF-7细胞中增殖和迁移[12]。相似地，本研究也发现miR-188在骨肉瘤组织中的的表达明显低于癌旁组织，提示miR-188可能在骨肉瘤中发挥抑癌作用。

已证实miRNA主要作用机制通过调节其转录后靶基因表达，参与肿瘤病理进程，研究miRNA作用机制关键是揭示miRNA的靶基因[13]。本研究发现miR-188在TGFA的3′-UTR上具有潜在的结合位点，且证实miR-188 mimic 能抑制TGFA野生型3′-UTR报告基因质粒的荧光素酶活性，而miR-188 抑制剂则产生相反效果，提示TGFA是miR-188的潜在靶基因。

本研究发现，在骨肉瘤患者组织中，TGF-α表达明显高于正常组织，这与既往研究结果类似。有报道TGF-α在骨肉瘤中组织和细胞中表达升高[14]；在非小细胞肺癌中，敲除TGFA将抑制NSCLC细胞增殖[15-16]。本研究结果和相关文献的报道均证实癌基因TGF-α在骨肉瘤生长转移中起关键作用。

本研究还发现过表达miR-188能抑制细胞的迁移能力，而上调TGF-α的表达则出现相反结果，同时miR-188抑制剂能促进细胞的迁移能力，而干扰TGF-α的表达也会出现相反结果，并且miR-188对细胞的调控效果可被TGF-α逆转，初步证实了miR-188是通过抑制TGF-α的表达从而调控骨肉瘤细胞的增殖和迁移。从整体动物实验结果也发现过表达miR-188中Ki-67的表达均明显低于对照组，而抑制miR-188后Ki-67的表达明显高于对照组，表明miR-188在裸鼠体内对骨肉瘤生长具有抑制作用，笔者还发现TGF-α在骨肉瘤裸鼠移植瘤模型组织中也呈现阳性信号。

综上，本结果表明miR-188表达降低可能与骨肉瘤的进展相关，进一步揭示了TGFA是miR-188发挥调控作用的关键靶基因，提示miR-188通过抑制TGF-α在骨肉瘤的发挥作用。