华蟾素抑制人鼻咽癌细胞系CNE2和HONE1增殖

赵 霞，蔡庆春，丁瑞敏，张 倩

(河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450004)

头颈部鳞状细胞癌是全球第5常见的恶性肿瘤，尽管治疗手段不断地改进，但其5年生存率仍仅有30%～40%[1-2]。其中，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高发于东南亚和中国华南地区的头颈部上皮恶性肿瘤，发病率约为25/10万，每年约有8万新增病例和5万死亡病例[3]。尽管常规化学药物治疗可改善NPC患者的总体生存率，但其预后仍不太理想[4]。因此，寻找NPC新的有效治疗手段具有重要意义。

华蟾素(cinobufagin，Cin)为干蟾蜍皮中提取的脂溶性物质，长期以来，其在中国和亚洲其他国家/地区一直用于中晚期肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌等多种恶性肿瘤的治疗[5-9]。但，Cin对NPC的作用及其机制尚未阐明。因此，在本研究旨在探索Cin在体外是否可以抑制NPC细胞系的增殖，并初步探究其发挥生物学效应的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与抗体：华蟾素(Cin)(Sigma-Aldrich公司)；胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；DMEM培养基(ThermoFisher Scientific公司)；CCK-8试剂盒、TUNEL试剂盒和细胞核蛋白、RIPA裂解缓冲液与线粒体蛋白抽提试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；DCFH-DA试剂盒(Molecular Probes公司)；BCA蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad公司)；细胞色素c(cytochrome c，Cytc)、Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的兔单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；增强型化学发光试剂盒(EMD Millipore公司)；GAPDH兔重组单克隆抗体和HRP-羊抗兔IgG二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.1.2 细胞：人鼻咽癌细胞系CNE2和HONE1(上海中国科学院细胞库)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：将细胞分为对照组和低、中、高剂量Cin处理组。待细胞贴壁后，低、中、高剂量Cin处理组分别用5、15和45 mg/L浓度的Cin处理，对照组仅接受与Cin等体积的DMSO。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活性：将CNE2和HONE1细胞以3×103个/孔的加在96孔板中。24、48和72 h后，每孔加入CCK-8溶液(20 μL/孔)，然后在培养箱中培养2 h。使用Spectra Max M5动功能微孔酶标仪记录490 nm处的吸光度(A)值。细胞活性=各Cin处理组A值/对照组A值×100%。

1.2.3 细胞形态的观察：将CNE2和HONE1细胞种植到6孔板(5×105个/mL)，48 h后，用相差显微镜在×100放大倍率下观察细胞形态，并用数码相机拍摄细胞的大体形态图像。

1.2.4 TUNEL染色检测凋亡：将CNE2细胞种植到6孔板(5×105个/mL)，48 h后，用PBS洗涤3次。使用4%甲醛固定细胞30 min，PBS洗涤2次后，加入含0.3% Triton X-100的PBS室温孵育5 min，并用PBS洗2次。在样品上加100 μL配置好的TUNEL工作液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次后，用含DAPI的抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜(激发波长550 nm，发射波长570 nm)下观察，并计算TUNEL阳性细胞比例。

1.2.5 活性氧(reactive oxygen species，ROS)的测定(DCF法)：将CNE2细胞种植到6孔板(5×105个/mL)，48 h后，用PBS洗涤3次。之后，根据说明书的指示，将细胞用荧光染料(2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)探针室温避光孵育30 min，在荧光显微镜下(激发波长450 nm，发射波长520 nm)观察并拍照，使用Image J软件进行定量计算。

1.2.6 蛋白质印迹分析(Western blot)检测Cytc、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表达：将CNE2细胞种植到6孔板(5×105个/mL)，48 h后，用PBS洗涤3次，收集细胞。细胞分成俩部分，一部分用细胞质蛋白抽提试剂盒分离细胞质蛋白和线粒体蛋白，用Western blot检测细胞质Cytc和线粒体Cytc的表达；另一部分用RIPA裂解缓冲液提取全蛋白，用Western blot检测Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 华蟾素(Cin)抑制NPC细胞系的细胞活性

与对照组(0 mg/L)比较，Cin处理24、48和72 h时，随着Cin剂量的增加，CNE2和HONE1细胞活性逐渐降低(P<0.05，P<0.01和P<0.001)(图1)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 mg/L group

2.2 华蟾素(Cin)处理诱导NPC细胞系形态改变

对照组(0 mg/L)细胞形态正常，在15 mg/L处理组，CNE2和HONE1细胞呈现拉丝和稀疏(细胞密度降低)现象，在45 mg/L处理组这种变化更加明显，并且在HONE1细胞中观察到细胞皱缩(图2)。

图2 华蟾素(Cin)处理对CNE2(A)和HONE1(B)的细胞形态的影响

2.3 华蟾素(Cin)处理促进NPC细胞系凋亡和细胞内ROS水平增加

与对照组(0 mg/L)比较，Cin处理组的CNE2细胞中TUNEL阳性细胞比例和ROS阳性细胞的比例均随着Cin剂量增加而增加(P<0.05，P<0.01或P<0.001)(图3)。

A.representative images of TUNEL staining(scale bar=200 μm); B.representative images of DCF fluorescence staining(scale bar=200 μm); C.statistical results of TUNEL positive cells; D.statistical results of ROS positive cells; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 mg/L group

2.4 华蟾素(Cin)对凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组(0 mg/L)比较，Cin处理组的CNE2细胞中线粒体Cytc和Bax表达降低，细胞质Cytc、Bcl-2和cleaved caspase-3表达升高(P<0.05，P<0.01或P<0.001)(图4)。

A.representative Western blot bands of the expression of mitochondrial apoptosis-related proteins; B.statistical results of relative expression levels of mitochondria Cytc and Bax; C.statistical results of relative expression levels of cytoplasmic Cytc, Bcl-2 and cleaved caspase-3; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 mg/L group

3 讨论

近年来，在传统医学中寻找替代抗癌药具有很大的研究前景[10]。很多种中药成分具有抑制恶性肿瘤细胞增殖并诱导其死亡的作用，从而达到消融恶性肿瘤的目的。Cin作为一种已上市的中药，其可在多种恶性肿瘤中发挥抗癌作用[5-9]。而目前，Cin对NPC的具体作用和机制还未阐明。因此，本研究探索了Cin对NPC细胞系的生物学作用，结果显示，Cin处理后的NPC细胞系(CNR2和HCNE1)的活性下降，凋亡增加，提示Cin也是潜在的抗NPC药物。

ROS和肿瘤的生物学进程相互交织。ROS在细胞功能和存活信号中起重要作用，细胞内ROS的积累最终可以激活细胞凋亡信号通路。最近的研究表明，诱导肿瘤细胞内ROS水平增加是一项重要的抗肿瘤策略[11]。线粒体是大多数细胞内ROS产生的场所，且线粒体过量生成的ROS然后能够靶向易受氧化损伤的mtDNA(mitochondrial DNA)等结构[12]。mtDNA损伤会损害电子传输链中涉及的蛋白质的mtRNA转录，导致呼吸链功能中断，ROS生成进一步增加，从而导致Cytc从线粒体释放、线粒体膜通透性改变和膜电位丧失和ATP合成受损[13]。这些事件最终通过线粒体途径导致细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白位于线粒体膜上，可以触发Cytc从线粒体释放到细胞质，导致caspase激活和细胞凋亡[13-14]。本研究发现Cin可诱导NPC细胞系(CNE2)内ROS生成水平增加，且进一步研究结果显示，Cin可使得NPC细胞系(CNE2)的Bax表达增加和Bcl-2表达降低，Cytc从线粒体释放到细胞质中，cleaved caspase-3水平增加；以上数据均提示，Cin抑制NPC细胞系(CNE2)增殖并诱导其凋亡的作用可能与其诱导ROS激活的凋亡途径相关。

综上所述，本研究证明了Cin能抑制NPC细胞系的增殖并诱导其凋亡，并且这一作用可能与ROS激活的凋亡途径相关。尽管，目前研究还存在一些不足，尚缺乏在体的实验证据，仍需继续深入推进Cin对NPC的治疗作用的研究。就目前的实验结果而言，本研究结果提示Cin有可能是潜在的NPC的治疗剂。