萝卜硫素减轻心脏移植模型大鼠缺血/再灌注损伤

王 帅，王建军，孙秀红，邬鹏宇，崔志成，李占清

(华北理工大学附属医院 1.心脏血管外科；2.重症医学科(ICU)，河北 唐山 063000)

心脏移植是终末期心脏病的首选治疗方法，然而缺血/再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,I/RI)是临床器官移植最常见的病理过程[1]，也是导致术后心功能不全和晚期并发症的主要相关因素[1-2]。减轻 I/RI是改善移植心脏预后的关键途径之一。

萝卜硫素(sulforaphane)广泛存在于十字科植物，在西兰花中含量最多，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌及抗炎等药理作用[3-6]。磷脂酰肌醇激酶-3/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/AKT)信号通路能够抑制细胞凋亡。有报道萝卜硫素可激活PI3K/AKT信号通路，减轻肾脏细胞的 I/RI[7]。PI3K/AKT信号通路激活后能抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的活性，进而抑制线粒体通透性转换孔开放，产生细胞保护作用。萝卜硫素对心脏移植的保护作用，是否是通过激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路尚不清楚。本研究用大鼠异位异体心脏移植模型，检测心肌细胞的损伤和细胞凋亡水平及PI3K/AKT信号通路在萝卜硫素诱导的心肌保护中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂:康斯特保护液(HTK液)、Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC水(上海生工生物工程有限公司)；萝卜硫素(格纯生物有限公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒、肌酸激酶(creatine kinase,CK)试剂盒、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)试剂盒和肌钙蛋白T(troponin T,TnT)试剂盒(北京义翘神州生物)；反转录试剂盒反转录和实时荧光定量PCR试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；线粒体提取试剂盒和线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)分析试剂盒(谷歌生物有限公司)；抗体分别为AKT、p-AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、tubulin(CST公司)。

1.1.2 动物：32只SPF级雄性12周龄Wistar大鼠(上海斯莱克生物有限公司，合格证号沪：2020-0213)。

1.2 方法

1.2.1 同种异体活体心脏移植模型构建：受体大鼠在移植前分为心脏移植组(对照组)和萝卜硫素处理组(每组n=8)，萝卜硫素处理组在移植前24 h经鼠尾静脉注射药物2.5 mg/kg，对照组给予同等剂量的0.9%氯化钠溶液。将供心的主动脉、主肺动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静脉进行端侧吻合。放开动脉夹即可见冠状动脉充血，10 s左右心脏复跳。所用的操作均在洁净条件下操作，术后注意大鼠保温，待大鼠清醒后，萝卜硫素处理组经鼠尾静脉再次注射萝卜硫素2.5 mg/kg，对照组给予同等剂量的0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 标本的采集：采静脉血，4 ℃ 2 500 r/min离心15 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中冻存。再灌注48 h后苯巴比妥钠20 mg/kg麻醉大鼠，取出大鼠心脏用于形态学和分子水平的研究。

1.2.3 生存率的分析:大鼠随机分为受体和供体，每组20只，所有供体心脏取出后于移植前冷藏于4 ℃ HTK液18 h，20只受体大鼠再次分为对照组和萝卜硫素处理组，萝卜硫素处理组的受体于移植前24 h经尾静脉注射萝卜硫素2.5 mg/kg，对照组为等量的0.9%氯化钠溶液，每天检查移植心脏的跳动，记录大鼠存活日，使用Kaplan-Meier分析大鼠生存率。

1.2.4 心肌酶学的检测：用全自动生化分析仪检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(TnT)的水平，判断心肌的损伤程度。步骤详见试剂盒说明书。

1.2.5 TUNEL染色检测移植心肌细胞凋亡水平：取心脏组织约50 mg，4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，然后切片，依次经过脱蜡和水化，3% H2O2浸泡15 min后，加入TUNEL染液反应30 min，PBS洗片最后加入DAB显色液后，在显微镜下拍照，计算心肌细胞的凋亡指数，凋亡指数=染色阳性细胞/总细胞。

1.2.6 大鼠心肌细胞线粒体的提取：用差速离心法分离线粒体和胞质成分，按照试剂盒说明书进行提取。

1.2.7 线粒体肿胀试验(mPTP开放试验)：将新鲜线粒体悬浮于肿胀缓冲液中，包含(mmol/L)：KCl 120，Tris·HCl 10，KH2PO45，MOPS 20。采用BCA蛋白定量试剂盒进行线粒体浓度分析，调节线粒体终浓度达到0.5 mg/mL，并接种于96孔板中，加入氯化钙诱导mPTP开放，利用520 nm吸光度(A)值评估线粒体肿胀程度。即读取每分钟吸光度(A)值，吸光度(A)值的差值/分钟即为吸光度(A)值下降率。

1.2.8 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因mRNA水平:加Trizol试剂振荡碾磨提取心脏组织总RNA，加氯仿取出混悬液中的蛋白组织，加异丙醇沉淀总RNA，用75%乙醇洗涤总RNA白色沉，DEPC水溶解总RNA，测RNA浓度后利用反转录试剂盒反转录，最后利用实时荧光定量PCR试剂盒检测基因的表达。

具体的引物序列如下：caspase-3 F:5′-ATCG ATCGATCGAGTCGGTAT-3′，R:5′-ATATATCGTGC ATGCTAGCGAT-3′；BaxF:5′-ATCTATCGATGCTGT GTAATATCCG-3′，R:5′-ACGCGCGCGCGTGTGTGT TAACCC-3′；β-actin F:5′-ATCGCGCGCGTATCGAT CGAT-3′，R:5′-ATCGCGCGCGACATTCGATTCC-3′。

1.2.9 Western blot检测PI3K-AKT通路蛋白表达水平：RIPA缓冲液裂解心脏组织，离心取上清进行蛋白浓度测定和SDS-PAGE。电泳结束后滤纸夹心法放入Bio-Rad湿转装置转膜。加入一抗4 ℃孵育过夜，一抗结合完成后加入配二抗室温结合2 h，加入ECL结合底物曝光显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 萝卜硫素对心脏移植大鼠生存率的影响

萝卜硫素处理组的生存率显著高于对照组(P<0.05)(图1)。

图1 萝卜硫素处理后同种异体心脏移植大鼠生存率

2.2 萝卜硫素对心脏移植大鼠心肌酶的影响

萝卜硫素处理组血清LDH、CK、CK-MB和TnT的浓度均低于对照组(P<0.05)(图2)。

P<0.001 compared with control

2.3 萝卜硫素对大鼠心肌细胞凋亡的影响

萝卜硫素处理组大鼠心肌细胞凋亡数量显著低于对照组(P<0.01)(图3)。

A.TUNEL staining; B.apoptosis index of myocardial cell; <0.01 compared with control group

2.4 萝卜硫素对心脏移植大鼠心肌细胞凋亡蛋白表达的影响

Caspase-3和Bax在萝卜硫素处理组的基因表达显著低于对照组(P<0.01)(图4)。

*P<0.01,**P<0.001 compared with control group

2.5 两组大鼠心肌线粒体比较

对照组的线粒体吸光度(A)下降率显著高于萝卜硫素处理组[(45.45±8.68)vs(18.37±4.39),P<0.01]。

2.6 萝卜硫素对心脏凋亡相关分子表达的影响

萝卜硫素处理组受体大鼠心脏组织中PI3K/Akt/GSK-3β明显被激活，AKT和GSK-3β的磷酸化水平明显增加(P<0.01)，GSK-3β下游caspase-3的剪切水平降低(P<0.01)(图5)。

A.Western blot; B.relative protein expression; <0.01 compared with control

3 讨论

心脏移植引起的 I/RI目前尚无理想的治疗方法，萝卜硫素在预防 I/RI肾损伤具有一定的作用[8]，萝卜硫素可逆转肾脏 I/RI后凋亡相关分子的高表达。有报道萝卜硫素对减轻 I/RI诱导的卵巢损伤具有保护作用[9-10]，还可抑制JNK和p38-MAPK依赖性活性氧诱导下的炎性反应和凋亡，在急性肝损伤及急性坏死性胰腺炎中发挥保护作用[11-12]。本研究表明萝卜硫素可以显著减少大鼠同种异体心脏移植术后大鼠的病死率，降低凋亡相关分子caspase-3和bax的表达，抑制心肌细胞凋亡，减轻心脏I/RI，提示萝卜硫素对心肌I/RI的保护作用可能通过抗凋亡途径实现的。

最新研究发现PI3K/AKT信号通路激活后，可通过使失活GSK-3β抑制mPTP开放，从而保护细胞 I/RI[13]，那么萝卜硫素可否通过激活PI3K/AKT信号通路，使GSK-3β失活来抑制mPTP的开放，从而减轻在临床心脏移植的心肌 I/RI，目前尚无相关研究。

本结果显示，萝卜硫素处理组中Akt和GSK-3β蛋白的磷酸化水平较对照组显著增加,GSK-3β下游的凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达在萝卜硫素治疗后显著降低，表明萝卜硫素可能通过激活PI3K/Akt/GSK-3β通路抑制心肌细胞凋亡。

综上所述，萝卜硫素可减少缺血/再灌注诱导的心肌病理改变，通过激活PI3K/AKT信号通路，使GSK-3β失活，抑制mPTP开放，保护移植心脏。此结果为提高心脏移植手术中心肌的保护提供了实验和理论依据。