低FODMAP饮食对溃疡性结肠炎模型大鼠TNF-α、IL-17表达的影响

陈燕 黄益倩 童晓清 章小艳 束龙 郑培奋

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种慢性非特异的肠道炎性疾病，其全球发病率逐年上升，发病机制涉及多方面因素，包括遗传易感性、上皮屏障缺陷、免疫反应失调、环境因素等[1]。近年来，低可发酵寡聚糖、双糖、单糖及多元醇（FODMAP）饮食在肠易激综合征（irritable bowel syndrome,IBS）患者中的应用研究受到了学者的广泛关注[2]。FODMAP是指人体难吸收的一些短链碳水化合物，研究表明，这些短链碳水化合物在小肠内不容易被吸收，但在结肠中却高度发酵而产气，进而导致腹胀和腹泻等症状加剧[3]。国外临床研究也证实，低FODMAP饮食能有效改善炎症性肠病患者的腹痛、腹胀等胃肠道症状[4]。本课题组前期研究也发现，低FODMAP饮食辅助药物治疗能明显改善UC大鼠辅助T细胞（Th）1和Th2细胞比例，降低转化生长因子-β1和叉头框蛋白3阳性表达[5]。然而，关于低FODMAP饮食是否与UC大鼠促炎因子表达相关，目前国内尚鲜见文献报道。为此，本研究拟探讨低FODMAP饮食对UC大鼠TNF-α和IL-17表达的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选择清洁级成年雄性SD大鼠40只，体重（200±10）g，购自浙江省实验动物中心，实验动物生产许可证号：SYXK（浙）2019-0002。饲养条件：光照12 h，温度（20.0±2.0）℃，环境相对湿度 40%～70%，自由饮水、进食，定期更换垫料。

1.2 主要试剂和仪器 IL-17抗体购自博奥森公司（批号：bs-2140R-50 μl，规格：50 μl）；TNF-α 抗体购自江莱生物公司（批号：JL13202，规格：96 T）；三硝基苯磺酸（TNBS）购自深圳市文乐生物科技有限公司（批号：R089840，规格：25 g/瓶）；美沙拉嗪缓释颗粒购自法国爱的发制药公司（批号：H2010006，规格：1.0 g/粒）；苏木精（批号：714094）、伊红（批号：BA4099）均购自德国BASO公司；HE试剂盒购自美国Richard-Allan Scientific公司；辣根过氧化物酶（批号：P8020，规格：1 g）、PBS（批号：P1010-2L，规格：2 L）均购自北京索莱宝公司；正置显微镜购自日本Olympus公司（型号：CX41）。

1.3 动物分组及造模 40只大鼠进行适应性喂养7 d后，按随机数字表法分为高FODMAP组、低FODMAP组、模型组和空白对照组，每组10只。除空白对照组外，参照Murano等[6]的造模方法，采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠法（5%TNBS+50%乙醇，按照 1∶1的比例配成灌肠液）制作UC大鼠模型。造模前禁食不禁水24 h，用大鼠灌胃针轻缓从肛门插入，深度约6 cm，推入灌肠液（100 mg/kg TNBS），推入后立即提尾倒立1 min后放回笼中自然苏醒，并常规饲养。

1.4 干预方法 大鼠造模后第4天，开始给予相应的干预措施。高FODMAP组大鼠给予定制的高FODMAP鼠粮，包括黄豆、小麦和黑麦制品、鱼粉、芒果、杏仁面和麦芽糖醇；低FODMAP组大鼠给予定制的低FODMAP鼠粮，包括大米、小米、燕麦、玉米、土豆、白菜和葡萄糖；模型组和空白对照组喂养饲料均为清洁级鼠粮，包括小麦、玉米、麸皮、豆柏和酵母粉等；上述鼠粮均参照文献[5]配制。高FODMAP组和低FODMAP组均予美沙拉嗪缓释颗粒灌胃治疗（美沙拉嗪颗粒配制成25.0 g/L 溶液，每次 0.02 ml/g，1次/d）；模型组和空白对照组均予等量0.9%氯化钠溶液灌胃；干预治疗疗程为14 d。末次给药24 h后，大鼠先吸入过量乙醚，再采用摘眼球法取血，离心后取血清备用，处死后迅速切取远端结肠肠管，沿纵轴切开选取溃疡最明显处病变肠段取材，若无溃疡则选取红肿糜烂较明显处病变肠段取材，并分为3份待检。

1.5 观察指标

1.5.1 疾病活动指数（DAI）评分 干预过程中观察各组大鼠每日体质量变化、粪便性状（是否成形）、便血等情况，计算出大鼠DAI评分。DAI评分＝体质量下降分数+粪便性状分数+便血分数。DAI评分标准如下：无体质量下降、大便性状正常、无便血记0分；体质量下降1%～5%记1分；体质量下降＞5%～10%、半稀便、大便隐血（+）记2分；体质量下降＞10%～15%记3分；体质量下降＞15%、稀便、肉眼血便记4分[7]。

1.5.2 结肠黏膜大体形态损伤评分 各组大鼠取1份结肠组织标本，观察结肠黏膜大体形态改变，并参照下列标准进行评分：无损伤为0分；黏膜充血为1分；溃疡面积＜受损面积的25%为2分；溃疡面积＝受损面积的25%～50%为3分；溃疡面积＞受损面积的50%为 4 分[8]。

1.5.3 结肠黏膜组织病理学评分 取1份结肠组织标本用甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察大鼠结肠黏膜组织损伤情况。100倍视野下随机选择8处进行评分并取均值，参照病理损伤评分系统。0分为正常肠黏膜；1分为缺少1/3隐窝；2分为缺少2/3隐窝；3分为固有层被单层上皮细胞覆盖和较少的炎症细胞浸润；4分为炎症细胞数量增多并有炎症细胞明显浸润。

1.5.4 结肠黏膜及血清TNF-α、IL-17水平检测 取1份结肠组织标本，用载玻片轻刮去结肠黏膜表面黏液，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，再使用载玻片刮取结肠黏膜组织，剪取约200 mg，冰上剪碎，再加入2 ml预冷的PBS，用匀浆器制成匀浆，4℃，12 000 r/min离心5 min，取上清液，-80℃冰箱保存。大鼠结肠黏膜及血清TNF-α、IL-17水平检测采用ELISA法，所有过程均严格按照试剂盒说明书操作。用纯化的大鼠TNF-α、IL-17抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入大鼠TNF-α、IL-17，再与辣根过氧化物酶标记的TNF-α、IL-17抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色。TMB在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNF-α、IL-17水平呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD）值，通过标准曲线计算样品中大鼠TNF-α、IL-17水平。

1.6 统计学处理 采用SPSS 26.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠一般情况比较 建模前，40只SD大鼠毛色光润，进食正常，反应灵活，大便呈颗粒状，无稀便及脓血便；而在建模后的第4天，除空白对照组大鼠外，其余大鼠均相继出现体质量下降，并且伴有黏液便、血便、倦怠懒动、活动减少、反应迟钝、毛发凌乱、拱背、饮食饮水减少等现象，提示造模成功。造模过程各组大鼠无死亡。

2.2 4组大鼠干预阶段DAI评分比较 高FODMAP组、低FODMAP组和模型组大鼠DAI评分均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组相比，低FODMAP组大鼠在干预的第7和14天时，DAI评分均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而高FODMAP组大鼠则在干预的第14天时，DAI评分出现明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与低FODMAP组相比，高FODMAP组大鼠在干预的第7、14天时DAI评分均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠干预阶段DAI评分比较（分）

2.3 4组大鼠结肠黏膜大体形态损伤评分比较 高FODMAP组和模型组大体形态损伤评分均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，高FODMAP组和低FODMAP组大体形态损伤评分均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与低FODMAP组相比，高FODMAP组大鼠大体形态损伤评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而低FODMAP组与空白对照组大体形态损伤评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 4组大鼠结肠黏膜大体形态损伤评分比较（分）

2.4 4组大鼠结肠黏膜组织病理学评分比较 高FODMAP组、低FODMAP组和模型组组织病理学评分均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，高FODMAP组和低FODMAP组组织病理学评分均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。结肠黏膜组织病理学检查见图1。

图1 各组大鼠结肠黏膜组织病理学检查所示（a：空白对照组；b：模型组；c：低FODMAP组；d：高FODMAP组；HE染色，×100）

表3 4组大鼠结肠黏膜组织病理学评分比较（分）

2.5 4组大鼠结肠黏膜和血清TNF-α、IL-17水平比较 与空白对照组相比，高FODMAP组、低FODMAP组和模型组结肠黏膜和血清TNF-α、IL-17水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组相比，高FODMAP组和低FODMAP组TNF-α、IL-17水平均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与低FODMAP组相比，高FODMAP组结肠黏膜TNF-α、IL-17水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表 4。

表4 4组大鼠结肠黏膜和血清TNF-α、IL-17水平比较（pg/ml）

3 讨论

UC是一种病因和发病机制尚未完全明确的结直肠炎症性疾病。目前临床对UC尚无有效的根治方法，且患者病情容易反复，病程较长。因此，临床的治疗目标是诱导并维持临床缓解以及黏膜愈合，防治并发症，从而改善患者生命质量[9]。临床上治疗UC的药物主要包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、硫嘌呤类药物、免疫抑制剂和生物制剂。与此同时，饮食作为辅助手段作用于UC的临床治疗越来越受到重视[10]。因此，本研究采用TNBS灌肠法建立UC大鼠模型，主要观察低FODMAP饮食对UC大鼠TNF-α和IL-17表达的影响。

随着我国IBS发病率的不断上升，FODMAP饮食的相关研究也日益引起学者关注。2016年的一项临床研究表明，高达86%的IBS患者在采用低FODMAP饮食时症状有所缓解[11]。而刊出在Gastroenterology杂志上的一项最新随机对照试验研究显示，为期4周的低FODMAP饮食对于管理静止期IBD患者的持续肠道症状是安全和有效的[12]。本研究结果发现，同常规饲料喂养UC大鼠相比，低FODMAP组大鼠的DAI评分、结肠黏膜大体形态损伤评分、结肠黏膜和血清TNF-α、IL-17水平更低。这一结果说明了低FODMAP饮食联合美沙拉嗪能够明显降低UC大鼠结肠黏膜相关炎性因子的表达，有助于接受药物治疗的UC大鼠快速恢复。低FODMAP饮食的作用机制可能是：（1）低FODMAP饮食减少了结肠气体的产生，避免结肠因气体产生而膨胀，引起腹部不适，Sloan等[13]在一项随机对照试验中发现，低FODMAP饮食可显著减少氢气的产生，改变菌群组成，但对结肠容积无显著影响；（2）低FODMAP饮食可以降低内脏的敏感性，张灵等[14]研究报道，低FODMAP饮食减少了人体难吸收的短链碳水化合物的代谢产物的产生，例如短链脂肪酸，而短链脂肪酸能诱导内脏超敏反应。

IL-17是CD4+效应T细胞亚群Th17细胞和CD8+效应性T细胞亚群Tc17细胞分泌的一种促炎症细胞因子，它能够刺激多种细胞分泌 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等多种促炎因子，诱导肠道的炎症反应[15]。肠道炎症状态时，初始CD4+T细胞在IL-23等前炎症细胞因子的作用下，可促进T细胞分化为Th17细胞，并诱导分泌 IL-17。既往研究结果表明，TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子与UC发病密切相关，并与UC的疾病活动呈正相关，且抗TNF-α单克隆抗体目前已用于UC的临床治疗[16]。本研究结果显示，模型组大鼠结肠黏膜TNF-α和IL-17水平较空白对照组均明显上升。而在低FODMAP饮食联合美沙拉嗪干预后，炎症因子水平均出现明显的下降，这可能是与低FODMAP饮食增加调节性T细胞产生[17]、减轻炎症反应、促进肠道黏膜修复有关。此外，研究表明，低 FODMAP饮食也可通过抑制NF-κB免疫炎症信号通路、加强肠上皮细胞间紧密连接而发挥其抗炎作用，最终达到治疗UC的作用[18]。

综上所述，低FODMAP饮食联合美沙拉嗪能明显降低UC大鼠DAI及结肠黏膜大体形态损伤评分，改善了炎症因子TNF-α和IL-17水平，为低FODMAP饮食在UC的临床应用提供实验与理论依据。