油菜素内酯促进芹菜中阿维菌素和辛硫磷残留降解效果研究

王紫娟 李 森 秦 潮 白宇仁 郑少文，*

(1 山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801；2 山西省农产品质量安全检验监测中心，山西 太原 030000；3 洪洞县综合检验检测中心，山西 洪洞 041600)

芹菜(ApiumgraveolensL.)为伞形花科芹属植物，在我国栽培历史悠久、种植面积广、产量高、销售量大[1-2]，由于芹菜适应性强，生长周期短，结合设施保护，已可做到四季生产，周年供应[3]。芹菜口感清脆，富含蛋白质、B族维生素、胡萝卜素等多种营养物质[4-5]，且叶茎中含有药效成分的芹菜苷、佛手苷内酯和挥发油，具有降压、降脂、护肝、抗癌等生理功效[6-7]。随着种植产业结构的调整，山西省芹菜种植面积逐年增大，病虫害也随之增加、逐渐严重，相应的农药使用剂量及次数也不断加大[8-9]。近年来，芹菜农药残留超标问题常有发生，给消费者带来了健康隐患[10]。

油菜素内酯(brassinolide，BR)又名芸苔素内酯、硕丰481、天丰素[11]，是公认的高效、广谱、无毒的植物生长调节剂，其渗透性强、内吸快，在极低浓度下，有明显地促进植物体营养生长的作用，亦能有效地增加叶绿素含量，提高光合效率，促根壮苗、保花保果；同时也可提高作物抗寒、抗旱、抗盐碱等能力，并能显著减少病虫害的发生，消除病斑缓解药害的发生，使作物快速恢复生长[12-13]。

目前，我国农药的使用不够规范，乱用滥用现象普遍，导致农作物的农药残留量普遍较高，严重影响农作物的安全采收上市，并威胁人类健康[14]。因此，农药残留问题受到社会广泛关注。根据前期市场调研和农药销售结果，芹菜在常规农药使用中阿维菌素和辛硫磷检出率和超标率均较高。阿维菌素是对害虫和螨类具有胃毒和触杀作用的一种大环内酯化合物，属于微生物源农药，易被土壤吸附，亦能被土壤微生物分解，已成为多种复配剂的有效成分[15]；阿维菌素作为一种神经性毒剂，能引起昆虫神经的抑制麻痹，从而起到杀虫的作用，人体中毒症状主要表现为烦躁、失眠、瞳孔扩大、四肢无力、肌肉颤抖，重则会引起抽搐、昏迷、呼吸衰竭。辛硫磷是一类高效低毒的有机磷杀虫剂[16]，具有药效高、防治谱广和成本低的特点，是一种刺激性的神经毒物，主要抑制害虫血液和组织中乙酰胆碱酯酶活性，引起中枢神经系统中毒[17]。研究表明，BR可促进农药在植物体内的降解和代谢[18-19]，已有学者在油菜[20]、芥菜[21]、鸭梨[22]等果蔬上进行过类似研究，但是对于BR能否促进芹菜中阿维菌素和辛硫磷的降解尚鲜有报道。基于此，本研究分析了BR对芹菜作物中农药残留降解的影响，旨在保证芹菜产品农药残留水平控制在安全范围，促进芹菜产业的可持续发展，以期为蔬菜产品中农药残留降解的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新津南实芹：青县纯丰蔬菜良种繁育场；1.8%阿维菌素乳油：山西奇星农药有限公司；40%辛硫磷乳油：山东埃森化学有限公司；0.01%油菜素内酯乳油：江西珀尔农作物工程有限公司；阿维菌素标准品(B1a含量为91.2%)、辛硫磷标准品(纯度≥99%)：阿拉丁试剂上海有限公司。

1.2 试验设计

试验在山西农业大学园艺站1号日光温室开展，以田间小区的方式进行，共分为9个小区，每12株芹菜作为一个试验小区，每个处理重复3次。各处理均以施药但不施BR为水平对照。试验期间禁止喷施类似农药。

1.2.1 阿维菌素和辛硫磷在芹菜上的降解动态 喷施阿维菌素及辛硫磷的剂量设为定量，于同一天内进行喷施。定植30 d后，按照1.5倍推荐剂量(阿维菌素75/667 mL·m-2、辛硫磷113/667 mL·m-2)对芹菜叶面进行均匀喷雾，喷到叶面滴液为止，施药1次，每个处理均做3次重复。分别于施药后的2 h及1、3、5、7、14、21、28 d采集芹菜样本，每小区均采样3株，预处理后待测。

1.2.2 喷施BR对芹菜中阿维菌素和辛硫磷残留降解动态 浓度：于施药前1 d喷施BR(浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.50 mg·L-1)，以施药自然降解为对照，喷到滴液为好。按照1.5倍推荐剂量喷施阿维菌素和辛硫磷。具体方法及采样时间与1.2.1一致。

次数：于施药前1 d喷施0.1 mg·L-1BR，喷到滴液为好。设3个处理：施药前喷施1次；在喷施1次的基础上每隔3 d喷1次，共喷施2次；在喷施2次的基础上每隔3 d喷1次，共喷施3次；以施药自然降解为对照。每次处理均做3次重复，于施药后2 h及1、3、7 d采集芹菜样本。

1.2.3 施药方式及采样处理方法 用小型喷壶向芹菜叶面喷施BR，用15 L容量的手动喷雾器向芹菜叶面喷施辛硫磷和阿维菌素。由于辛硫磷具有见光分解的特性[23]，选择在傍晚进行喷施，自上而下，以叶片茎秆均匀喷施，并有药液从植株上滴下为止。

试验按随机采样的方法，从每个小区间随机采取3株，避免采摘有病虫害的植株，采样量确保不少于20 g，采回的芹菜样品擦去泥土放于塑料板上进行切碎混匀，然后进行匀浆，将匀浆好的样品置于-22℃冰箱保存。

1.3 测定项目与方法

准确称取匀浆后的10.00 g芹菜试样置于离心管中，加入15 mL乙腈溶液、6 g无水硫酸镁、1 g柠檬酸钠和1 g氯化钠，剧烈震荡1 min，4 000 r·min-1离心5 min，使乙腈相和水相分层。准确吸取15 mL上清液于RV8旋转蒸发仪(上海莱睿科学仪器有限公司)中蒸发近干，用1.5 mL乙腈溶液复溶转移至15 mL刻度离心管中。称取适量的石墨化炭黑粉末(graphitized carbon black，GCB)、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)粉末和MgSO4加入上述乙腈溶液中，4 000 r·min-1离心2 min，将上清液移入2 mL刻度离心管中，经0.45 μm滤膜过滤后上高效液相色谱仪测定[24]。

阿维菌素液相色谱测定条件：色谱柱C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长245 nm；流动相V(甲醇)∶V(水)=85∶15；进样量20 μL；流速1.0 mL·min-1； 柱温30℃；保留时间约为25 min。

辛硫磷液相色谱测定条件：色谱柱C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；检测波长285 nm；流动相V(甲醇)∶V(水)80∶20；进样量20 μL；流速1.0 mL·min-1；柱温35℃；保留时间约为25 min。

1.4 数据分析

1.4.1 定性分析 所测得的样品溶液中未知农药的保留时间(retention time，RT)分别与该农药的标准溶液在同一色谱柱上的保留时间进行比较，如果样品溶液中某农药的两组保留时间与该农药的标准溶液中某一农药的两组保留时间相差都在±0.05 min内，可确定为该农药[25]。

1.4.2 定量结果计算 根据公式计算供试样品中被测农药的残留量：

(1)

式中，X表示样品中被测药剂的残留量，mg·kg-1；c表示标准溶液中被测药剂的浓度，mg·L-1；V表示样品定容体积，mL；A1表示标准工作溶液中被测药剂的峰面积；A2表示样品中被测药剂峰面积；m表示样品质量，g。

1.4.3 半衰期 根据公式计算半衰期：

Ct=C0×e-kt

(2)

T1/2=ln2/k

(3)

式中，Ct表示t时刻农药的浓度，mg·kg-1；C0表示农药初始浓度，mg·kg-1；T1/2表示半衰期，d；k表示消解速率常数。

1.4.4 数据统计方法 采用Microsoft Excel 2010进行数据处理；Origin 8.6软件作图；SPSS Statistics 17.0软件进行单因素方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 阿维菌素在芹菜中的残留自然降解动态

阿维菌素在芹菜中的残留降解动态试验结果如表1所示。在喷施阿维菌素2 h后，芹菜中阿维菌素的残留量为0.426 3 mg·kg-1，喷施后第7天，阿维菌素的残留量为0.103 1 mg·kg-1，降解率达到75.82%，喷施后第28天，阿维菌素在芹菜中的残留量低于仪器最低定量限，未检出；芹菜的安全采收期为21 d。将残留量结果进行统计分析，得到阿维菌素在芹菜中的残留降解动态回归方程为：C=0.378 2e-0.105t，相关系数R=0.908 9，半衰期为6.60 d。阿维菌素在芹菜中的残留降解动态符合一级动力学反应模式(式2)，其结果具有较高的相关性。随着采样时间的延长，阿维菌素的残留量呈逐渐下降的趋势。

表1 阿维菌素在芹菜中的降解动态Table 1 Degradation dynamics of avermectin in celery

2.2 喷施不同浓度的BR对芹菜中阿维菌素残留降解动态的影响

由图1可知，随着采样时间的延长，CK和处理组中阿维菌素含量均呈下降的趋势，但不同处理间阿维菌素降解程度有所不同。对于相同时间点不同处理而言，0.10 mg·L-1BR是试验中促进阿维菌素残留降解的最适浓度。在喷施后2 h和1、3、5、7、14 d时，0.10 mg·L-1BR处理组阿维菌素含量相对于CK分别降低了10.25%、9.17%、10.11%、19.82%、31.72%和52.32%。在喷施后第14天时，0.1 mg·L-1BR处理芹菜中阿维菌素含量为0.042 2 mg·kg-1，低于我国规定的阿维菌素在芹菜上的最大残留限量0.05 mg·kg-1[26]， 达到国家标准；而在自然降解条件下，需到喷施后第21天时才能达到国家标准。由表2可知，不同浓度BR处理后，阿维菌素在芹菜中的残留降解均符合一级动力学反应模式，其结果具有较高的相关性；且以0.10 mg·L-1BR处理后半衰期最短，为4.03 d，安全采收期为14 d，较自然降解提早7 d。

注：不同小写字母表示同一采样时间不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments at 0.05 level in the same sampling time. The same as following.图1 不同浓度BR对芹菜中阿维菌素的降解动态Fig.1 Degradation dynamics of avermectin in celery with different concentrations of BR

表2 不同浓度BR促进芹菜中阿维菌素降解的动力学参数Table 2 Kinetic parameters of avermectin degradation in celery promoted by different concentrations of BR

2.3 喷施不同次数的BR对芹菜中阿维菌素残留降解动态的影响

由图2可知，随着采样时间的延长，CK和处理组中阿维菌素含量均呈下降趋势，与CK相比，经BR处理后阿维菌素的降解速度更快。对于相同时间点不同处理而言，喷施2次BR是试验中促进阿维菌素残留降解的最适次数；在施药后第1、第3、第7天时，较CK分别降低了10.84%、56.03%和58.39%，在第7天时阿维菌素含量为0.042 9 mg·kg-1，低于我国规定的阿维菌素在芹菜上的最大残留限量0.05 mg·kg-1，达到国家标准；而在自然降解条件下，需到第21天时才能达到国家标准(表1)。由表3可知，喷施不同次数BR处理后，阿维菌素在芹菜中的残留降解符合一级动力学反应模式，其结果具有较高的相关性；且以喷施2次BR处理后半衰期最短，为2.11 d，安全采收期为7 d，较自然降解提早14 d。

图2 喷施不同次数BR对芹菜中阿维菌素的降解动态Fig.2 Degradation dynamics of avermectin in celery by spraying BR with different times

表3 喷施不同次数BR促进芹菜中阿维菌素降解的动力学参数Table 3 Kinetic parameters of different times of BR promoting avermectin degradation in celery

2.4 辛硫磷在芹菜中的残留自然降解动态

辛硫磷在芹菜中的残留降解动态试验结果如表4所示。在喷施辛硫磷2 h后，芹菜中辛硫磷的残留量为0.747 2 mg·kg-1，喷施后第5天，辛硫磷的残留量为0.320 7 mg·kg-1，降解率达到57.08%，喷施后第21天，辛硫磷在芹菜中的残留量低于仪器最低定量限，未检出；芹菜的安全采收期为14 d。将残留量结果进行统计分析，得到辛硫磷在芹菜中的残留降解动态回归方程为：C=0.860 8e-0.228t；相关系数R=0.990 4；半衰期为3.04 d。辛硫磷在芹菜中的残留降解符合一级动力学反应模式，其结果具有较高的相关性。随着采样时间的延长，辛硫磷的残留量呈逐渐下降的趋势。

表4 辛硫磷在芹菜中的降解动态Table 4 Degradation dynamics of phoxim in celery

2.5 喷施不同浓度的BR对芹菜中辛硫磷残留降解动态的影响

由图3可知，随着采样时间的延长，CK和处理组中辛硫磷含量均呈下降趋势但不同处理间辛硫磷的降解程度有所不同。整体而言，比较相同时间点的不同处理，0.10 mg·L-1BR是试验中促进辛硫磷残留降解的最适浓度。施药后2 h和1、3、5、7 d时，0.10 mg·L-1BR处理组比CK分别降低了40.66%、43.64%、68.91%、77.85%和78.80%，在第7天时，芹菜中辛硫磷含量为0.033 3 mg·kg-1，低于我国规定的辛硫磷在芹菜上的最大残留限量0.05 mg·kg-1[26]，达到国家标准；而在自然降解条件下(表4)，需到第14天时才能达到国家标准。由表5可知，不同浓度BR处理后，辛硫磷在芹菜中的残留降解符合一级动力学反应模式，其结果具有较高的相关性；且以0.10 mg·L-1BR处理后半衰期最短，为1.83 d，安全采收期为7 d，较自然降解提早7 d。

图3 不同浓度BR对芹菜中辛硫磷的降解动态Fig.3 Degradation dynamics of phoxim in celery with different concentrations of BR

表5 不同浓度BR促进芹菜中辛硫磷降解的动力学参数Table 5 Kinetic parameters of phoxim degradation in celery promoted by different concentrations of BR

2.6 喷施不同次数的BR对芹菜中辛硫磷残留降解动态的影响

由图4可知，随着采样时间的延长，CK和处理组中辛硫磷含量均呈现下降的趋势，与CK相比，经BR处理后辛硫磷的降解速度更快。对于相同时间点不同处理而言，喷施2次BR是试验中促进辛硫磷残留降解的最适次数；在施药后第1、第3天时辛硫磷残留量比CK分别降低了43.71%和85.46%，在施药后第7天时，辛硫磷含量低于仪器检出限，未检出；而在自然降解条件下(表4)，需到第14天时才能达到国家标准。由表6可知，不同次数的BR处理，辛硫磷在芹菜中的残留降解符合一级动力学反应模式，其结果具有较高的相关性；且以2次BR处理后半衰期最短，为1.05 d，安全采收期为7 d，较自然降解提早7 d。

图4 不同次数BR对芹菜中辛硫磷的降解动态Fig.4 Degradation dynamics of phoxim in celery by BR with different times

表6 不同次数BR促进芹菜中辛硫磷降解的动力学参数Table 6 Kinetic parameters of different times of BR promoting phoxim degradation in Celery

2.7 最适喷施浓度BR促进阿维菌素与辛硫磷降解的效果比较

由上述研究结果可知，降解阿维菌素和辛硫磷残留的最适BR浓度均为0.10 mg·L-1。由图5可知，随着采样时间的延长，阿维菌素和辛硫磷降解速率均呈上升趋势且在每个采样时间段辛硫磷的降解速率均高于阿维菌素的降解速率。表明在最适浓度0.10 mg·L-1BR条件下，BR对辛硫磷的降解效果优于对阿维菌素的降解效果。

注：不同小写字母表示同一项目不同采样时间之间差异显著性(P<0.05)。Note: Different lowercase letter indicate significant difference between different sampling time of the same item at 0.05 level.图5 最适BR浓度下阿维菌素和辛硫磷降解速率比较Fig.5 Comparison of degradation rates of avermectin and phoxim under optimal BR concentration

2.8 最适喷施次数BR促进阿维菌素与辛硫磷降解的效果比较

由上述结果可知，降解阿维菌素和辛硫磷残留的最适BR喷施次数均为2次。由图6可知，施药后第3天喷施2次BR辛硫磷的降解速率为86.12%，高于阿维菌素的降解速率(64.38%)。表明在最适喷施次数，即2次条件下，BR对辛硫磷的降解效果优于对阿维菌素的降解效果。

注：不同小写字母表示最适BR次数下不同处理间差异显著性(P<0.05)。Note: Different lowercase letter indicate significant difference among different treatments under the optimal BR times at 0.05 level.图6 最适BR次数下阿维菌素和辛硫磷降解速率比较Fig.6 Comparison of degradation rates of avermectin and phoxim under optimal BR times

3 讨论

农药残留超标问题，不仅影响果蔬的生产和进出口贸易，还会影响人类身体健康[27]。寻求一种加速降解农产品中农药化合物残留的有效措施，既可以扩大农药的使用范围，也可以有效地解决农药残留量过高的问题[28]。张莹等[22]研究表明，BR能够有效促进鸭梨果实中有机磷农药毒死蜱的降解，其降解效果显著优于自然降解。Xia等[29]研究表明，在采收前第7天施用BR，能够显著减少番茄、黄瓜、白菜等蔬菜中30%～70%的多菌灵、百菌清、毒死除虫蜱和抗菌除虫菊酯等农药的有害化学物质残留。本试验结果表明，喷施BR可有效促进芹菜中阿维菌素和辛硫磷的降解，且以0.10 mg·L-1BR效果最佳，喷施次数以2次效果最佳，较CK处理可提前达到国家规定的阿维菌素和辛硫磷在芹菜中的最大残留限量标准(0.05 mg·kg-1)。 最佳喷施条件下，BR对辛硫磷的降解效果优于对阿维菌素的降解效果。BR能够降解植物体内的农药残留，其原因可能与激发植物内在解毒机制，提高植物的抗氧化能力有关[30-31]。Zhou等[32]研究表明，BR能提高植物体内解毒酶活力、解毒基因表达，并促进谷胱甘肽的合成与再生，从而降解植物体内的农药残留。于高波[33]研究表明，BR能够促进植物体内谷胱甘肽等相关物质的合成，启动以谷胱甘肽为底物的轭合反应；BR也能够诱导植物体三相解毒代谢相关基因的表达，从而加速植物体内谷胱甘肽对农药进行的轭合反应等解毒作用，进而促进农药在植物体内的降解代谢。夏晓剑[34]研究也表明，BR能显著提高农药氧化修饰、代谢中间体扼合、代谢终产物运输等过程的相关解毒酶活力和基因表达，从而降低黄瓜体内氯氰菊酯、多菌灵和百菌清的残留。喷施农药会使植物处于逆境胁迫状态，推测阿维菌素和辛硫磷具有同样的效果，逆境胁迫会导致植物活性氧过度累积，对植物造成氧化损害[35]。而通过喷施BR可激发植物内在解毒机制，提高植物的抗氧化能力；在这个过程中，多种参与农药降解的解毒基因表达和酶活性均会提高，在解毒基因“指导”之下，合成的蛋白酶能将农药逐步转化为水溶性物质或者低毒、无毒物质，有的可直接排出植物体内，从而起到降解植物体内农药残留的作用[36-37]，但其机制还有待进一步深入研究。

4 结论

BR能够有效促进芹菜中阿维菌素和辛硫磷的降解，其降解效果优于自然降解。施用BR最适浓度为0.10 mg·L-1；喷施2次效果最佳，但促进效果存在一定差异，喷施0.10 mg·L-1的BR和喷施2次BR对辛硫磷的降解效果均优于阿维菌素的降解效果，与农药本身的物理化学性质以及对解毒机制的诱导强度有关。