犬细小+犬冠状+贾第鞭毛虫抗原三合一胶体金检测卡的制备与评价

庄昕哲，孙晓笛

（杭州奥泰生物技术股份有限公司，浙江 杭州 310018）

犬细小病毒病是由犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）引起的急性传染病，可通过呕吐物、粪便及唾液传播。犬细小病毒病发病率、病死率高，传染性强[1-2]，多发生于寒冷季节，6月龄以下幼犬最易感，纯种犬较杂种犬发病率明显更高[3-4]。临床上可分为肠炎型和心肌炎型。肠炎型的主要临床表现为呕吐、腹泻、体温升高、粪便稀而腥臭、体重明显下降；心肌炎型则无明显临床特征，易突然衰竭死亡[5-6]。犬冠状病毒病是一种由犬冠状病毒（canine coronavirus，CCV）引起的高度接触性肠道传染病，以急性肠炎、水样腹泻、血便、呕吐和脱水为主要特征[7-9]。该病多发于寒冷季节，主要通过粪便传播，也可垂直传播，2～4 月龄幼犬感染发病率几乎为100%，病死率50%；成年犬的病死率相对较低[10-11]。贾第鞭毛虫（Giardia）寄生于动物小肠，可引起人畜共患的慢性肠道原虫性感染疾病，即贾第鞭毛虫病[12-13]。Giardia 多感染6 月龄以下的幼年犬猫，主要临床表现为幼年犬猫急性、慢性或间歇性腹泻以及长期腹泻导致营养不良、发育迟缓；成年犬猫感染后多无临床表现。该病以粪便及污水为主要传播途径，流行率高，严重时可继发犬细小病毒病及犬冠状病毒病等严重传染病[14-15]。

上述动物传染病均以传染性极强为主要特征，尤其易对幼年犬猫的健康造成危害，及时发现治疗尤为重要。胶体金检测为临床上最方便快捷的检测方法之一。因此，本研究采用胶体金免疫层析技术，制备可快速检测CPV、CCV和Giardia的三合一胶体金检测卡，评价其检测效果，为CPV、CCV和Giardia的临床诊断提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂：抗犬细小病毒抗体（CPV-Ab1）、抗犬细小病毒抗体（CPV-Ab2）、抗犬冠状病毒抗体（CCV-Ab1）、抗犬冠状病毒抗体（CCV-Ab2）、抗贾第鞭毛虫抗体（Giardia-Ab1）、抗贾第鞭毛虫抗体（Giardia-Ab2）、鼠IgG、羊抗鼠IgG均购自傲锐生物医药科技有限公司；链霉亲和素和生物素购自Sigma 公司；犬细小病毒阳性样本（CPVAg）、犬冠状病毒阳性样本（CCV-Ag）和贾第鞭毛虫阳性样本（Giardia-Ag）均由杭州宠物医院提供。

主要仪器：连续点膜机及点金标机（海宁威尔芬自动化设备有限公司）、可编程切割机（杭州格伦坤科技有限公司）、鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 CPV+CCV+Giardia抗原三合一胶体金检测卡的制备

1.2.1 胶体金颗粒的制备

1 mL 1%的氯金酸加入双蒸水定容至100 mL，煮沸后保持3 min，搅拌并快速加入2 mL 1%的柠檬酸三钠溶液；95°C搅拌6～8 min，冷却后定容至原体积，4°C保存。

1.2.2 胶体金标记抗体

取3 份适量的胶体金溶液，分别调至最适pH 值，加入CPV-Ab1、CPV-Ab1、Giardia-Ab1，充分搅拌1 h；加入20%的浓度为0.2% PEG-2000 稳定剂，1 200 r/min 离心30 min，4°C保存。

1.2.3 金标垫的制备

将已被胶体金标记的CPV-Ab1、CCV-Ab1、Giardia-Ab1 分别与鼠IgG 金标抗体复合物混合，均匀涂布于聚酯纤维膜，37°C烘干，封入装有干燥剂的铝箔袋。

1.2.4 NC膜的制备

1.2.4.1 CCV胶体金检测条的NC膜的制备

将链霉亲和素和羊抗鼠IgG作为检测线（T线）和质控线（C 线）分别包被于NC 膜，37 °C 烘干，封入装有干燥剂的铝箔袋。

1.2.4.2 CPV胶体金检测条和Giardia胶体金检测条的NC膜的制备

将CPV-Ab2、Giardia-Ab2 和羊抗鼠IgG 作为检测线（T线）和质控线（C线）分别包被于NC膜，37 °C烘干，干燥密封保存。

1.2.5 CCV样品垫的制备

CCV-Ab2与生物素（biotin）耦联，按照0.006 g/L浓度加入玻纤溶液混匀，均匀涂布于玻璃纤维，37 °C 烘干，干燥密封保存。

1.2.6 CPV+CCV+Giardia 抗原三合一胶体金检测卡的组装

将准备的3个产品的样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫分别依次粘贴于各自洁净的PVC，切割4.0 mm宽的试纸条，按顺序装入三合一测试板，干燥密封保存。

1.3 检测原理、判定标准及检测方法

1.3.1 CCV检测原理及判定标准

采用链霉亲和素和生物素信号放大的双抗夹心法进行检测。若样本中含有犬冠状病毒抗原（CCV-Ag），则与样本垫中的CCV-Ab2-biotin 结合，被金标垫上的CCVAb1 捕获，形成CCV-Ab2-biotin-CCVAg-CCV-Ab1 抗体金标复合物；在横向层析的作用下继续流动至NC膜，被T线处的链霉亲和素捕获，形成抗体-抗原-抗体固相复合物，呈现红色条带；继续层析至质控线C 处，溶液中的鼠IgG金标物与羊抗鼠IgG结合，呈现红色条带。

若样本中不含有CCV-Ag，则检测线处不呈现红色条带，仅质检线处呈现红色条带。

1.3.2 CPV、Giardia检测原理及判定标准

采用双抗夹心法进行检测。若样本中含有犬细小病毒抗原（CPV-Ag），则与金标垫中的犬细小病毒抗体（CPV-Ab2）结合；在横向层析的作用下，继续流动至NC膜，被T 线处的犬细小病毒抗体（CPV-Ab1）捕获，形成CPV-Ab2-CPV-Ag-CPV-Ab1 抗体抗原固相复合物，呈现红色条带；继续层析至质控线C处，溶液中的鼠IgG金标物与羊抗鼠IgG结合，呈现红色条带。

若样本中不含有CCV-Ag，则检测线处不呈现红色条带，仅质检线处呈现红色条带。Giardia检测同理。

1.3.3 检测方法

于地上或犬的肛门处采集适量犬呕吐物或粪便，与缓冲液搅拌混匀取出，确保充分提取样品。

将测试板置于干净平整的表面，分别垂直滴加3 滴样品（约120 µL）于测试板S 孔，5～10 min 判读结果，15 min后结果无效。

1.4 CPV+CCV+Giardia 抗原三合一胶体金检测卡质量评价试验

1.4.1 特异性试验

采用3个批次各9个CPV、CCV和Giardia抗原胶体金检测卡分别检测CDV、CPV、CAV、CRV、CCV和Giardia的阳性样本，观察并记录结果，评价其特异性。

1.4.2 灵敏度试验

将CPV 高浓度阳性样本稀释成不同浓度：320.0、160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0 和2.5 HAU/mL；将高浓度的CCV 重组抗原稀释成不同浓度：100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5µg/L；将Giardia高浓度样本稀释为不同浓度：625 000、125 000、62 500、31 250、15 625、3 125、2 500、1 000、500 和0 cysts/mL。采用组装好的CPV、CCV 及Giardia 抗原胶体金检测卡分别测试，观察并记录结果，评价其灵敏度。

1.4.3 重复性试验

分别制备3 批CPV+CCV+Giardia 抗原胶体金检测卡，采用3 个批次的胶体金检测卡分别检测CPV、CCV 和Giardia的阴性、中阳性和高阳性样品。每一批次每组样本各10份，观察并记录结果，评价其在同批次和不同批次间的重复性。

1.4.4 稳定性试验

1.4.4.1 加速稳定性试验

制备3 批CPV、CCV 和Giardia 抗原胶体金检测卡，分别45 °C 保存0、7、14、21、28、35、42、56、77、84 d 和55 °C下0、7、14、21、28、35、42 d 后进行试验。每个时间点分别检测CPV、CCV 和Giardia 阴性对照品、弱阳性对照品、中阳性对照品和强阳性对照品各3份，观察并记录结果。

1.4.4.2 实时稳定性试验

制备3 批CPV、CCV 和Giardia 抗原胶体金检测卡，室温条件进行0、6、12、15、18、21、24月的稳定性试验。

每个时间点分别检测CPV、CCV 和Giardia 阴性对照品、弱阳性对照品、中阳性对照品和强阳性对照品各3份，观察并记录结果。

1.4.5 与RT-qPCR检测结果符合率

收集经RT-qPCR 检测的3 批数量分别为82、179 和162 个的临床样本，采用CPV、CCV 及Giardia 抗原胶体金检测卡分别进行检测，观察记录结果并计算胶体金检测与RT-qPCR检测结果符合率。

1.4.6 与其他品牌检测结果对比

分别采用上述制备的CPV、CCV 和Giardia 抗原胶体金检测卡与A 公司的CPV、CCV 和Giardia 抗原胶体金检测卡分别对CPV、CCV和Giardia阴性和样本各7份进行检测，观察并记录结果。

2 结果与分析

2.1 特异性试验结果（见表1）

表1 特异性试验结果Tab.1 Results of specificity test 单位：个

由表1可知，仅CPV阳性样本在CPV检测线和质检线处出现红色条带，结果为阳性；仅CCV阳性样本在CCV检测线和质检线处出现红色条带，结果为阳性；仅Giardia 阳性样本在Giardia抗原检测线和质检线处出现红色条带，结果为阳性；其余结果均为阴性。结果表明，CPV 胶体金检测卡与CDV、CAV、CRV、CCV 和Giardia 均无交叉反应；CCV 胶体金检测卡与CDV、CAV、CRV、CPV 和Giardia 均无交叉反应；Giardia 抗原胶体金检测卡与CDV、CAV、CRV、CCV和CPV均无交叉反应。CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡均特异性良好。

2.2 灵敏度试验结果（见表2）

由表2 可知，CPV-Ag 浓度分别为320.0、160.0、80.0、40.0、20.0、10.0 HAU/mL 时，均呈阳性结果；浓度低于10.0 HAU/mL 时，呈可疑结果或阴性结果。CCV-Ag 浓度分别为100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.0µg/L时，均呈阳性结果；浓度低于2.0 µg/L 时，呈可疑结果或阴性结果。Giardia-Ag 浓度分别为625 000、125 000、62 500、31 250、15 625、3 125 cysts/mL 时，均呈阳性结果；浓度低于3 125 cysts/mL时，呈阴性结果。

表2 灵敏度试验结果Tab.2 Results of sensitivity test 单位：个

结果表明，CPV、CCV 及Giardia 抗原胶体金检测卡灵敏度均较好，分别可检测CPV-Ag 浓度低至10.0 HAU/mL的样本、CCV-Ag 浓度低至2.0µg/L 的样本和Giardia-Ag浓度低至3 125 cysts/mL的样本。

2.3 重复性试验结果（见表3）

由表3 可知，同批次CPV、CCV 及Giardia 抗原胶体金检测卡分别检测10份阴性样本，结果均为阴性；分别检测10 份中阳性样本和强阳性样本，结果均为阳性；且不同批次同组样本的检测结果也一致。结果表明，CPV、CCV 及Giardia抗原胶体金检测卡的重复性均良好。

表3 重复性试验结果Table 3 Results of reproducible experimental 单位：个

2.4 稳定性试验结果

2.4.1 加速稳定性试验结果

同一批次及不同批次内共9 个检测板，使用CPV、CCV 和Giardia 阴性样本分别于45 °C 条件下0、7、14、21、28、35、42、56、77、84 d 和55 °C 下0、7、14、21、28、35、42 d检测，均显示阴性；CPV、CCV和Giardia 弱阳性样本、中阳性样本和强阳性样本检测时均显示阳性。结果表明，CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡在45 °C 84 d或在55 °C 42 d 时的检测结果均有效;根据阿伦尼乌斯公式推算该产品可保存2年。

2.4.2 实时稳定性试验结果

同一批次和不同批次内共9个测试板使用CPV、CCV和Giardia 阴性样本在0、6、12、15、18、21、24 月检测，结果均显示阴性；CPV、CCV 和Giardia 弱阳性样本、中阳性样本和强阳性样本检测结果均显示阳性。结果表明，该产品在24月内具有稳定性。

2.5 与RT-qPCR检测结果符合率（见表4）

由表4 可知，与RT-qPCR 检测结果相比，胶体金检测卡检测CPV 的阴性符合率为100.00%，阳性符合率为95.74%，总符合率为97.56%；CCV 的阴性符合率为97.52%，阳性符合率为93.10%，总符合率为96.09%；Giardia的阴性符合率为95.87%，阳性符合率为95.12%，总符合率为95.68%。结果表明，CPV、CCV和Giardia抗原胶体金检测卡检测与RT-qPCR检测结果基本一致。

表4 RT-qPCR与胶体金检测结果比较Tab.4 Comparison of RT-qPCR and colloidal gold detection results单位：个

2.6 与其他品牌产品检测对照结果（见表5）

表5 与其他品牌产品检测对照结果Tab.5 Results of controled test with A company 单位：个

由表5 可知，CPV、CCV 和Giardia 各7 份阴性样本通过二者的检测在检测线处均无红色条带出现，质检线处出现红色条带，显示阴性；CPV、CCV和Giardia各7份阳性样本通过二者的检测在检测线和质检线处均出现红色条带，显示阴性。结果表明，二者产品均能够有效检测CPV、CCV及Giardia。

3 讨论

各项试验结果表明，制备的CPV+CCV+Giardia 抗原三合一胶体金检测卡具有良好的特异性，不与CDV-Ag、CAV-Ag、CRV-Ag、CCV-Ag、Giardia-Ag 和CPV-Ag 除对应抗原外任何一种抗原发生交叉反应；灵敏度较高，分别可检测CPV 浓度低至10.0 HAU/mL 的样本、CCV 浓度低至2.0µg/L的样本和Giardia浓度低至3 125 cysts/mL 的样本；对于不同批次或同批次的不同样本的检测重复性良好；45 °C 84 d 内或在55°C 42 d 内热稳定性良好，室温条件下24个月内均稳定，检测效果良好；对经RT-qPCR检测的82 个CPV 相关样本、179 个CCV 相关样本以及162 个Giardia相关样本进行胶体金检测，结果显示，与RT-qPCR检测结果相比，胶体金检测卡检测CPV 的阴性符合率为100.00%，阳性符合率为95.74%，总符合率为97.56%；CCV的阴性符合率为97.52%，阳性符合率为93.10%，总符合率为96.09%；Giardia的阴性符合率为95.87%，阳性符合率为95.12%，总符合率为95.68%，其检测结果基本一致。

4 结论

本试验制备的CPV+CCV+Giardia 抗原三合一胶体金检测卡具有特异性好、灵敏度高、重复性好、稳定性高、结果准确率高的优点，能够快速、准确地检测CPV、CCV 及Giardia抗原。