采用正交试验优选辣蓼黄酮制备工艺的研究

郑钧文，张 文，成 静，黎 江，胡庭俊

（广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005）

辣蓼为一年生草本植物，广泛分布于我国各省[1-2]，具有消炎镇痛、抑菌杀虫、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性[3-5]，广泛应用于医药、食品、农牧林渔等行业[6-9]。黄酮类化合物是辣蓼重要的活性成分之一。近年来，为提高辣蓼黄酮提取率，相关研究人员对其提取方式进行了大量探索，如索式提取法、加热回流提取法、微波提取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法等。因使用设备及操作方式不同，各种提取方式各有优劣[10-12]。

为优化辣蓼黄酮提取工艺、降低提取成本，本研究采用乙醇溶液作为溶剂，对辣蓼药材进行加热回流提取，提取液经旋转蒸发浓缩至一定体积，利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定其芦丁、槲皮素、槲皮苷含量，采用正交试验法研究料液比、乙醇浓度、提取次数和提取时间对辣蓼黄酮浓缩液中黄酮含量的影响，寻找最佳提取条件，为辣蓼黄酮的规模化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药品

辣蓼（广西壮族自治区玉林市中药市场）、水溶性二氧化硅（广西普大动物保健品有限公司）。

芦丁对照品（100080-201811）、槲皮素对照品（100081-201610）、槲皮苷对照品（111538-201606），均来自中国食品药品检定研究院。

1.1.2 主要仪器

Waters e2695 高效液相色谱仪（Waters 公司）、Waters 2998 二极管阵列检测器（Waters 公司）、RE-2000A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市子华仪器有限责任公司）、CD-UPT-II-20 L 纯水仪（成都越纯科技有限公司）、SB-5200 DTDN超声波清洗器（宁波新芝科技股份有限公司）、HH-S2数显恒温水浴锅（金坛市医疗器械厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 辣蓼黄酮提取液的制备

根据罗文涓等[13]、朱瑜等[14]有关辣蓼黄酮分离提取工作的基础，采用正交试验设计优化提取方法。

称取50 g辣蓼药材于冷凝回流装置，按设定的相应条件（料液比、乙醇浓度、提取次数和提取时间）对辣蓼进行提取。添加相应体积和浓度的乙醇溶液将辣蓼药材浸泡0.5 h，80 ℃水浴加热提取。所得提取液以8 层纱布过滤，保留滤液，向剩下的滤渣中加入相同体积、浓度的乙醇溶液，再次水浴；合并几次滤液，以20～25µm定性滤纸抽滤，取滤液减压（70 ℃，真空度为-0.09 MPa）旋转蒸发浓缩至80 mL 以下，加蒸馏水补至80 mL，制得辣蓼黄酮浓缩液。正交试验因素水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平设计Tab.1 L9(34)orthogonal test factor level design

1.2.2 芦丁、槲皮素、槲皮苷的含量测定

1.2.2.1 色谱条件

选用Waters X Bridge C18（4.6 mm×250 mm,5µm）色谱柱，A 相为UP 水，B 相为甲醇，C 相为0.3%磷酸溶液，D 相为乙腈；C 相∶D 相=84%∶16%；柱温30 ℃，等度洗脱，洗脱时间为80 min，流速为1 mL/min，进样体积为20µL。

1.2.2.2 对照品溶液制备

精密称量芦丁、槲皮素和槲皮苷5 mg，分别加入甲醇制备0.50 g/L标准品母液。

分别抽取2 mL 3种母液加甲醇定容至10 mL，即得含量为0.10 g/L的芦丁、0.10 g/L槲皮素、0.10 g/L槲皮苷标准品溶液。

分别抽取2 mL 3 种母液，加甲醇定容至10 mL，得含量为0.10 g/L 的芦丁、0.10 g/L 槲皮素、0.10 g/L 槲皮苷，共计0.30 g/L标准品的混合标准品溶液。

1.2.2.3 供试品溶液的制备

取辣蓼黄酮浓缩液1 mL，加甲醇定容至10 mL制得供试品溶液。

1.2.3 辣蓼黄酮提取物的制备及含量计算

1.2.3.1 辣蓼黄酮提取物的制备

按正交结果最佳的条件提取制备辣蓼黄酮浓缩液，每50 g 辣蓼药材经醇提，旋转蒸发浓缩成80 mL 药液，加入40 g 的水溶性二氧化硅混匀，过40 目筛，55 ℃烘干，既得辣蓼黄酮提取物。

1.2.3.2 干浸膏的制备及得率测定

取10 mL最佳工艺制备的辣蓼黄酮浓缩液，55 ℃烘干恒重，精密称量，计算干浸膏得率。

式中：W为干浸膏质量，V1为浓缩液总体积，Wn为药材总质量，V2为取样体积。

以所得芦丁、槲皮苷、槲皮素总质量为主指标（权重系数0.7），干浸膏得率为次指标（权重系数0.3）对辣蓼黄酮正交提取工艺进行综合评分。

干膏得率越高，说明提取的杂质越多，不利于制剂工艺的成型。因此，以干膏得率越低评分越高，综合评分以百分制表示。

式中：W1为辣蓼黄酮浓缩液中芦丁、槲皮苷和槲皮素总质量；Wh为辣蓼黄酮浓缩液中芦丁、槲皮苷和槲皮素最大含量；Wx为干浸膏得率；Wt为干浸膏最大得率。

1.2.3.3 辣蓼黄酮提取物中黄酮含量

计算加入二氧化硅的辣蓼黄酮提取物中黄酮的含量。

式中：W1为辣蓼黄酮提取物中所含芦丁、槲皮素和槲皮苷总含量；W2为辣蓼黄酮提取物总质量。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果（见表2、表3）

由表2、表3 可知，4 个因素的影响大小依次为A＞B＞C＞D、A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C1＞C2、D3＞D1＞D2。

表2 辣蓼黄酮提取工艺正交试验结果Tab.2 Orthogonal test results of extraction process of Polygonum hydropiper flavonoids

表3 正交试验方差分析Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

最佳提取工艺为A3B3C3D3，即料液比1∶20、乙醇浓度80%、提取3次、每次提取2 h。

2.2 最佳工艺制备的辣蓼黄酮提取物含量

采用最佳正交工艺A3B3C3D3制备得80 mL 辣蓼黄酮浓缩液，加入40 g 水溶性二氧化硅，过40 目筛烘干，得43.48 g辣蓼黄酮提取物，总有效成分质量为3256.64 mg。

按公式（3）计算，最佳制备工艺得到的辣蓼黄酮提取物中含7.48%的辣蓼黄酮。

2.3 最佳工艺验证试验（见表4）

表4 辣蓼黄酮提取物制备工艺验证结果Tab.4 Validation results of preparation process of Polygonum hydropiper flavonoids extract

由表4 可知，平均干浸膏得率为65.86%，平均总有效成分质量为3 268.44 mg，制得的辣蓼黄酮提取物平均含7.51%的辣蓼黄酮。结果表明，按此工艺提取辣蓼黄酮可靠、稳定。

3 讨论

芦丁、槲皮苷和槲皮素是辣蓼黄酮中主要的生物活性成分。因此，本研究选择芦丁、槲皮苷和槲皮素的总含量作为辣蓼醇提物中黄酮含量的评价指标。田欢等[15]对葡萄籽中的芦丁进行提取的研究结果表明，80 ℃条件下，芦丁具有最佳提取效果。吕海涛等[16]研究发现，以甲醇为溶剂，温度低于80 ℃时，槲皮素的提取量随温度升高而增加。杨秀利等[17]研究表明，温度为80 ℃时，荨麻中槲皮苷的提取率最高。因此，本研究直接选用80 ℃作为提取温度，并选择极性较大、价格相对低廉、无毒、可回收的乙醇作为溶剂对辣蓼黄酮进行提取。

黄酮含量的测定常采用紫外分光光度法和HPLC 法。中药提取试验中产生的相关物质和杂质较多，相较紫外分光光度法，HPLC法能够更准确、有效地对药物成分进行分离，测定结果更加准确[18]。实际操作中HPLC 法节省人力和时间、操作简便。因此，本研究选择HPLC法对辣蓼黄酮中的黄酮类物质进行测定。

此前试验发现，当本研究中流动相C 相（0.3%的磷酸溶液）与D相（乙腈）比例为76∶24以上，槲皮苷与槲皮素已具有良好的分离度，但是芦丁的分离度不佳；在逐步增加流动相比例的过程中，芦丁处的分离度趋好；但超过84∶16时，最晚出峰的槲皮素拖尾严重，且槲皮素出峰时间过晚即增加测定时间，故以84∶16的比例为最佳。

辣蓼黄酮提取物是由醇提法提取的辣蓼黄酮浓缩液，经水溶性二氧化硅赋型得到的单方制剂。本研究以HPLC法对辣蓼黄酮浓缩液中所含芦丁、槲皮苷和槲皮素总量进行测定，将黄酮含量作为主指标，干浸膏得率作为次指标探究不同提取条件对辣蓼黄酮提取的影响。经正交试验确定，辣蓼黄酮乙醇提取法最佳工艺为A3B3C3D3，即料液比为1∶20、乙醇浓度为80%、加热提取3 次、每次提取2 h。利用HPLC法测得在此工艺条件下提取辣蓼所得主要黄酮成分为槲皮苷和芦丁，每50 g 辣蓼药材可提取得到约0.65 g芦丁、2.62 g槲皮苷，未检出槲皮素。按本研究最佳工艺提取辣蓼药材的芦丁含量远高于李明[19]对来自16 个产地的辣蓼提取测得的芦丁含量（0.657 8～0.997 5 mg/g）；本研究提取得到的槲皮苷含量也远高于张宏武等[20]对水辣蓼药材测得的0.083 6%～0.587 4%的槲皮苷含量。

除最佳工艺提取的辣蓼黄酮浓缩液未检出槲皮素外，本研究中其他正交提取条件下制备得到的辣蓼黄酮浓缩液中均未检出槲皮素。于晓亮等[21]研究表明，不同月份采收的同产地辣蓼中各种化学成分具有差异性，不同产地、不同部位的辣蓼所含化学成分亦有不同。何立美等[22]研究表明，广西玉林所产的辣蓼中芦丁、槲皮苷、槲皮素的含量由大到小依次为槲皮苷＞芦丁＞槲皮素，与本研究结果相一致；且玉林辣蓼中的槲皮素含量仅为32.66µg/g，这可能是本研究未检测出槲皮素的原因。但按照本研究中的最佳提取工艺提取的芦丁和槲皮苷含量远高于其他工艺，因此，尽管未检出槲皮素也不影响此提取工艺的可行性和科学性。

4 结论

辣蓼黄酮的最佳提取工艺为料液比1∶20、乙醇浓度80%、加热提取3次、每次提取2 h。该方法辣蓼黄酮提取率高且成本相对较低，可为辣蓼黄酮的大规模生产提供理论依据。