高效液相色谱-串联质谱法测定食用油脂中合成辣椒素的不确定度评估

李姣

摘 要：目的：评定高效液相色谱-串联质谱法测定食用油脂中合成辣椒素含量的不确定度，提高测定结果的准确度和可信度，找出对不确定度影响最大的关键性因素。方法：依据 CNAS-GL 006：2019 化学分析中不确定度的评估指南和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），采用高效液相色谱-串联质谱法测定食用油脂中合成辣椒素含量，建立不确定度评定的数学模型，通过对标准品溶液配制、样品溶液的配制、测量重复性以及标准曲线拟合这4个方面引入的不确定度进行分析，确定各个不确定度分量，得到扩展不确定度。结果：按置信区间为95%，合成辣椒素含量为（0.374±0.044） ?g/kg，k=2。结论：测量结果的不确定度的主要来源是样品测量重复性引入的，其次是标准品溶液和样品溶液的配制，其他分量引入的不确定度相对较小。

关键词：食用油脂;合成辣椒素;高效液相色谱-串联质谱法;不确定度

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of synthetic capsaicin content in edible oil by HPLC-tandem MS， improve the accuracy and credibility of the measurement results， and find out the key factors that have the greatest impact on the uncertainty.Methods： Synthetic capsaicin content in edible oils was determined by HPLC-tandem mass spectrometry according to CNAS-GL 006：2019 Guidelines for Evaluation of Uncertainty in Chemical Analysis and Evaluation and presentation of Measurement Uncertainty by JJF 1059.1—2012，establish a mathematical model of uncertainty evaluation， analyze the uncertainty introduced in standard solution preparation， sample solution preparation， measurement repeatability， and standard curve fitting， and determine each uncertainty component，get the extended uncertainty.Results： According to the 95% confidence interval， the synthetic capsaicin content is （0.374±0.044） ?g/kg， k=2. Conclusion： The main source of uncertainty in measurement results is the introduction of sample measurement repeatability， followed by the preparation of standard solution and sample solution， and the uncertainty introduced by other components is relatively small.

Keywords： edible oil and fats; synthetic capsaicin; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; uncertainty

辣椒作為常用的烹饪调料，在烹饪过程中被广泛使用。因此，辣椒也成为我国人民饮食中最喜欢添加的调味料之一。调味料中合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素物质因其结构相对稳定，在烹饪过程中不容易被破坏并溶于油中，因而在废弃食用油脂中通常会残留这些成分，而正常食用油中几乎不含辣椒素类的物质。目前辣椒素以其使用范围广、热稳定性良好、脂溶性较好等特点成为食用油脂分辨研究检测中的热点[1-4]，也是检测食用油质量的重要方法。

我国是食用油消费大国，食用油的安全问题已成为消费者关注的热点问题之一。国家市场监督管理总局于2018年发布了《食用油脂中辣椒素的测定BJS 201801》。该方法可适用于食用油脂中辣椒素（天然辣椒素、合成辣椒素、二氢辣椒素）含量的测定，方法指出当测定的样品中辣椒素（合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素）总含量大于或等于1.0 ?g/kg时，该油脂样品可能存在异常。

本文采用上述补充检验方法测定食用油脂中合成辣椒素含量，并进行不确定度评定。提高测定结果的准确度和可信度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱联用仪（AB Triple Quad 5500）;超声清洗机（Elma Elmasonic P）;天平（梅特勒xp205，d=0.01 mg）;天平（梅特勒AE200，d=0.1 mg），涡旋混合仪（IKA MS3）;乙腈、甲醇（Fisher Chemical LC/MS）;甲酸（Fisher Chemical色谱纯）;二氯甲烷（诺尔施公司色谱纯）;氢氧化钠、浓硫酸（成都科隆化学品公司优级纯）;一级水（美国密理博公司）。

固相萃取柱： Cleanert S C18-SPE ，1 000 mg/6 mL（天津博纳艾杰尔科技有限公司）;合成辣椒素对照品（纯度98%;编号：BWB52508;CAS号：2444-46-4;来源：北京北方伟业计量技术研究院）;食用油脂（拉萨市某粮油加工店自制菜籽油）。

1.2 试验方法

1.2.1 仪器条件

（1）色谱方法。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100 mm，1.7 ?m（Waters公司）;流速：0.3 mL/min;柱温：40 ℃;进样量：2 ?L;流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液（梯度洗脱）。

（2）质谱方法。电离方式：电喷雾正离子模式;检测方式：多反应监测（MRM）;雾化气压力：30 psi;离子喷雾电压：5 000 V;干燥气温度：500 ℃;干燥气流速：8 L/min;离子对294.1/137.1*，294.1/170.1;去簇电压120 V，碰撞能量24 eV、13 eV。其中，*指定量离子。

1.2.2 样品前处理

准确称取1 g左右样品于10 mL具塞塑料试管中，加入1 mL二氯甲烷，再加入3 mL 2%氢氧化钠溶液，涡旋提取10 min，4 000 r/min离心10 min，取上层水相;残留有机相再用3 mL 2%氢氧化钠溶液重复提取1次，合并水相，再用稀硫酸溶液（V∶V=1∶15）调节pH至2～3后进行固相萃取操作。C18 SPE小柱预先用3 mL乙腈淋洗3次，再用3 mL纯水淋洗2次进行活化，然后将调节完pH值的水相提取液加入小柱，控制流速至1～2滴/s，待全部溶液通过SPE小柱后，以3 mL超纯水淋洗2次，弃去流出液，最终以3 mL乙腈洗脱2次。乙腈洗脱液50 ℃氮吹近干，用1.0 mL甲醇溶解后过微孔滤膜（0.22 ?m，有机相），供上机测定。

1.3 建立数学模型

样品中合成辣椒素的计算公式为：

X=C×V/m（1）

式中：X-样品中合成辣椒素的含量，?g/kg;C-从标准曲线得到的样品中合成辣椒素质量浓度，ng/mL;V-样品定容体积，mL;m-样品取样量，g。

2 结果与分析

2.1 测量不确定度的来源分析

食用油脂中合成辣椒素测量不确定度的来源包括：①标准品溶液配制引起的不确定度urel（d）;②样品溶液配制引起的不确定度urel（r）;③试样重复测定时引入的不确定度urel（s）;④标准曲线拟合引起的不确定度urel（p）。

2.2 各不确定度分量的评定

2.2.1 不确定度传播律

由于数学模型是线性模型，采用相对标准不确定度合成公式为：

2.2.2 标准品溶液配制引起的相对不确定度urel（d）

（1）标准品纯度引起的相对不确定度urel（d1）。合成辣椒素对照品纯度98%，纯度标准偏差为2%。按均匀分布，包含因子k=。

（2）标准品称量引起的相对不确定度urel（d2）。按照天平检定证书和《电子天平检定规程》（JJG 1036—2008），十万分之一天平称量范围为0.01～5.00 g时，最大允许误差为±0.05 mg，按均匀分布，包含因子k=，2次称量后获得标准品质量（天平清零也带来称量不确定度）。标准品质量为10.80 mg。则：

（3）标准品稀释定容引起的相对不确定度urel（d3）。

标准品稀释定容引起的不确定度主要来源于玻璃量器和移液器。一般来说，玻璃量器引起的不确定度来源于允许误差和温度变化。按照检定证书和《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006），容量为50 mL的容量瓶（A级）容量允许误差为±0.05 mL，容量允许误差引入的不确定度认为是三角分布，包含因子k=，则：

由于液体的膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，故只考虑液体的体积膨胀，配制标准品的溶剂为甲醇，甲醇的膨胀系数为0.001 20/℃，实验室温度

19 ℃和校正温度20 ℃偏差1 ℃。因此，温度偏差产生的体积增量为50 mL×0.001 20/℃×1℃=0.06 mL，假设体积变化服从三角分布，包含因子k=，则：

经查《移液器检定规程》（JJG 646—2006）可知，移液器容量允许误差和测量重复性误差。100～1 000 ?L移液器容量最大允许误差为1 000 ?L×1.0%=10 ?L=0.01 mL，容量允许误差引入的不确定度认为是三角分布，包含因子k=，则：

按照上述方法计算所用玻璃量器和移液器引入的不确定度，结果见表1。

称取标准品10.80 mg，于50 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到211.68 ?g/mL的标准品溶液，稀释标准品溶液得到52.92 ng/mL标准贮备液。稀释标准贮备液得到浓度为0.105 84 ng/mL、0.211 68 ng/mL、1.058 40 ng/mL、5.292 00 ng/mL、10.584 00 ng/mL和21.168 00 ng/mL标准工作曲线溶液。在此过程中，100～1 000 ?L移液器使用2次，20～200 ?L移液器使用6次。50 mL的容量瓶（A级）使用1次，25 mL的容量瓶（A级）使用1次，10 mL的容量瓶（A级）使用1次，1 mL的容量瓶（A级）使用6次。则由玻璃量器和移液器的使用引起的相對不确定度为：

综合以上3个不确定度分量，标准品溶液配制引起的相对合成不确定度为：

2.2.3 样品溶液配制引起的相对不确定度urel（r）

（1）样品称量引起的不确定度。万分之一天平称量范围为0.1～50 g时，最大允许误差为±0.5 mg，按均匀分布，包含因子k=，2次称量后获得样品质量（天平清零也带来称量不确定度）。样品称样量为1 g（1 000 mg）。则样品称量引入的相对不确定度计算过程为：

（2）样品定容引起的相对不确定度。移液器urel（V1）=0.004 590 6。综合2个不确定度分量，样品溶液配制引入的相对合成不确定度为：

2.2.4 试样重复测定时引入的相对不确定度urel（s）

对本样品中合成辣椒素进行6次独立测试，每个样品重复测量2次。样品中合成辣椒素含量重复性测定结果见表2。

因此，重复性测定引起的相对合成不确定度为：

2.2.5 标准曲线拟合引入的不确定度urel（p）

采用6个浓度水平的标准溶液，每个标准溶液测2次，按照外标法拟合，得到线性方程

y=257 10.674 74x-2 700.849 23，其相关系数r=0.999 74。

标准曲线相关数据见表3。

因此，标准曲线拟合引入的不确定度为：

式中：P-样品溶液测量次数;n-标准溶液的测量次数;C-标准溶液平均浓度，ng/mL;C0-由曲线计算的样品溶液浓度，ng/mL;B0-线性方程截距;B1-线性方程斜率;SR-拟合标准偏差;Cj-第j次测量时标准溶液的浓度，ng/mL;Aj-第j次测量时标准溶液的峰面积。

故u（p）=0.001 493 6;

2.3 测量不确定度评定结果

合成辣椒素测定的各不确定度分量见表4。

食用油脂中合成辣椒素相对合成不确定度为：

样品中合成辣椒素平均含量为0.374 ?g/kg，则其标准不确定度为：

u（X）= 0.058 73×0.374 =0.021 97 μg/kg

根据测量不确定度评估指南对一般检测实验室要求[5]，在置信概率P=95%时，取k=2，因此扩展不确定度为：U=k×u（X）=2×0.021 97=0.044 ?g/kg。

合成辣椒素含量X=（0.374±0.044） ?g/kg，k=2。

3 结论

由评定结果可知，测量结果的不确定度的主要来源是样品测量重复性，其次是标准品溶液和样品溶液的配制，其他分量引入的不确定度相对较小。因此，在实际操作过程中，增加样品测定次数，减少人为误差是优化不确定度的有效途径。这要求检验人员具备与检验工作相适应的操作水平，适当增加对照品的称样量，尽量减少稀释步骤，转移、稀释时使用检定级别较高的玻璃量器，以提高检测结果的准确性。

参考文献

[1]罗辉泰，黄晓兰，吴慧勤，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时快速测定食用油中9种外源性杂质成分[J].分析测试学报，2019，38（5）：532-538.

[2]刘诗瑶，吴文林，肖全伟，等.超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱质谱快速筛查和定量检测食用油脂中的天然辣椒素、合成辣椒素和二氢辣椒素[J].食品工业科技，2020，41（13）：256-263.

[3]吕晓涵，蒋锦琳，杨静，等.基于特征波长建模的近红外光谱技术检测辣椒素含量[J].浙江大学学报，2019，45（6）：760-766.

[4]吴娟，汤见平，薛元強，等.高效液相色谱-荧光检测法快速检测植物油中的辣椒素和二氢辣椒素[J].中国油脂，2020，45（12）：118-121.

[5]国家认证认可监督管理委员会.检验检测机构资质 认定能力评价 检验检测机构通用要求：RB/T 214—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.