荣筋拈痛方对白细胞介素-1β诱导的体外大鼠软骨细胞自噬相关基因表达的影响

潘丹虹 李路 王文义 林晴 付长龙 吴广文 叶锦霞

【摘 要】目的：观察荣筋拈痛方对白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的体外大鼠软骨细胞自噬相关基因表达的影响，探讨其防治膝骨关节炎的作用机制。方法：取4周龄SD大鼠膝关节软骨，进行软骨细胞的体外分离培养，选取第2代软骨细胞甲苯胺蓝染色进行细胞鉴定。经IL-1β 10 ng·mL-1诱导建立体外软骨细胞炎症模型，诱导成功后，给予荣筋拈痛方（50，100，200 μg·mL-1）孵育48 h。将细胞分为空白对照组，模型对照组，荣筋拈痛方低、中、高剂量组。分别采用CCK-8法检测荣筋拈痛方对软骨细胞活性的影响，qPCR法检测软骨细胞中LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA表达，Western Blot法观察自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin 1的蛋白表达水平。结果：与模型对照组比较，荣筋拈痛方低、中、高剂量组均显著提高细胞活力，呈剂量依赖性增加（P < 0.01）;模型对照组较空白对照组LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表达水平升高（P < 0.05）;经100 μg·mL-1荣筋拈痛方干预后LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表达水平降低（P < 0.05）。结论：荣筋拈痛方可能通过抑制自噬水平，从而具有延缓膝骨关节炎退变的作用。

【关键词】 膝骨关节炎;荣筋拈痛方;软骨细胞;自噬;白细胞介素-1β;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rongjin Niantong Fang（荣筋拈痛方）on theexpression of autophagy related gene of interleukin-1β-induced rat chondrocytes in vitro and its mechanism in the prevention and treatment of knee osteoarthritis.Methods：The knee cartilages of 4-week-old SD rats were isolated and cultured in vitro.The second-generation chondrocytes were stained with toluidine blue for cell identification.Via IL-1β 10 ng·mL-1，The chondrocyte inflammation model in vitro was induced.After successful induction，Rongjin Niantong Fang（50，100，200 μg·mL-1）was used for incubation for 48 h.The cells were divided into a blank control group，a model group and the low，medium and high dose groups.The effect of Rongjin Niantong Fang on chondrocyte activity was detected by the CCK-8 method;The mRNA expressions of LC3Ⅱ and Beclin 1 in chondrocytes were detected by qPCR;The ratio of autophagy protein LC3Ⅱ/Ⅰ and the protein expression level of Beclin 1 were observed by Western Blot.Results：Compared with the model control group，the cell viability in the low，medium and high dose groups of Rongjin Niantong Fang significantly increased in a dose-dependent manner（P < 0.01）;The mRNA of LC3Ⅱ and Beclin 1 and the protein expression of LC3Ⅱ/Ⅰ and Beclin 1 in the model control group were higher than those in the blank control group（P < 0.05）;After the intervention of Rongjin Niantong Fang（100 μg·mL-1），the mRNA of LC3Ⅱ and Beclin 1 and the protein expression levels of LC3Ⅱ/Ⅰ and Beclin 1 decreased（P < 0.05）.Conclusion：Rongjin Niantong Fang may delay the degeneration of knee osteoarthritis by inhibiting the level of autophagy.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Rongjin Niantong Fang（榮筋拈痛方）;chondrocytes;autophagy;interleukin-1β;rats

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以关节软骨退行性改变和关节炎症为特征的慢性骨关节疾病[1]，多见于中老年人，年龄≥60岁的人群中约有80%的人出现骨关节炎（osteoarthritis，OA）[2]。自噬是细胞生存、分化和发育必不可少的途径，在炎症反应中具有双向调节作用，在促进和抑制炎症反应方面同等重要。白细胞介素-1β（IL-1β）被普遍认为是引起关节软骨基质降解的主要促炎症细胞因子，常作为OA体外退变软骨细胞模型诱导剂。前期研究表明，荣筋拈痛方具有多靶点成分，临床防治KOA效果明显[3-5]。因此，本研究选用荣筋拈痛方作为干预媒介，以体外退变软骨细胞作为研究载体，观察荣筋拈痛方对退变软骨细胞自噬的影响，为临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 选取1月龄SPF级雄性SD大鼠10只，体质量90～100 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005。

1.2 实验药物 荣筋拈痛方由牛膝、当归、羌活等药物组成。荣筋拈痛方冻干粉由江阴天江药业有限公司生产，采用纯水回流提取法，常温浸泡30 min，加热冷凝回流1.5 h，重复3次提取收集汤药，在冷冻机低温干燥24 h制备成荣筋拈痛方冻干粉。其安全性及质量控制均已经完成鉴定，以确保成分均一性、稳定性和有效性，符合用药标准。

1.3 实验试剂与仪器 IL-1β（美国Sigma公司，批号MKCL5731）;LC3B、Beclin 1、GAPDH引物由通用生物系统有限公司合成;LC3A/B一抗（美国CST公司，批号4）;Beclin 1一抗（美国Abcam公司，批号GR3254931-2）;GAPDH一抗（美国Abcam公司，批号GR3316865-9）;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa公司，批号AJ11541A）;TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本TaKaRa公司，批号AK31128A）;DMIL/DFC295倒置显微镜（德国Leica公司）;ND-2000C超微量核酸分析仪（美国Thermo公司）;CFX96 Touch实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）;逆转录仪（德国 Eppendorf公司）。

2 方 法

2.1 软骨细胞的培养及鉴定 参照课题组前期基础[6-7]，2只SD大鼠经质量分数为1%的戊巴比妥麻醉后脱颈处死，经体积分数为75%的无水乙醇浸泡5 min，摘取其双侧膝关节纯水冲洗后经体积分数为75%的无水乙醇浸泡数分钟后转移至超净工作台操作：先用PBS漂洗3遍，提取的软骨碎片置入含质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶的蓝盖瓶于37 ℃，100 r·min-1水浴摇床消化，每小时吸取1次上清液，120目尼龙网筛过滤，所得滤液置于离心机，离心半径12.29 cm，以1000 r·min-1离心5 min，弃上清液，收集软骨细胞沉淀，重复3次;用含体积分数为10%的胎牛血清的低糖DMEM于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱进行原代培养，消化培养得到稳定且状态良好的软骨细胞，采用甲苯胺蓝染色法对第2代软骨细胞进行鉴定;第2代软骨细胞爬片长至90%后，弃旧培养液，加入无菌PBS轻柔冲洗3遍;加入1 mL质量分数为4%的多聚甲醛并在室温下进行固定，30 min后弃固定液，无菌PBS冲洗3遍;弃无菌PBS溶液，每张载玻片加0.2 mL细胞专用甲苯胺蓝染色液，室温孵育30 min，蒸馏水洗净，室温晾干，中性树脂封片后光学显微镜下观察记录。

2.2 实验分组与处理 将第2代软骨细胞悬液以1×105·mL-1的密度接种于6孔板，随机将细胞分为空白对照组，模型对照组，荣筋拈痛方低、中、高剂量组。空白对照组：质量分数为10%的FBS + 低糖DMEM。模型对照组：质量分数为10%的FBS + 低糖DMEM，经10 ng·mL-1 IL-1β（DMEM完全培养基配制）诱导24 h。荣筋拈痛方低、中、高剂量组：质量分数为10%的FBS + 低糖DMEM，經10 ng·mL-1 IL-1β诱导24 h后，吸弃培养液换成50，100，200 μg·mL-1不同浓度的荣筋拈痛方再干预48 h。

2.3 CCK-8法检测荣筋拈痛方对软骨细胞活性的影响 将消化重悬后的软骨细胞以5×104·mL-1的密度，按每孔100 μL接种于96孔板内贴壁培养24 h;每组设6个复孔，经10 ng·mL-1 IL-1β诱导24 h;弃培养液，换成50，100，200 μg·mL-1不同浓度的荣筋拈痛方再干预48 h;避光条件下每孔加入10 μL CCK-8试剂置于37 ℃培养箱孵育4 h后，用酶标仪震荡30 s，450 nm读取OD值。

2.4 q-PCR检测各组软骨细胞LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表达 用Trizol法分离提取各组的总RNA，浓度测定后，按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒操作步骤依次进行去除基因组DNA反应、反转录反应得到相应组别的cDNA;接着按TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂说明书建立PCR体系，以95℃ 30 s、95℃ 3 s、60℃ 30 s、40个循环、Melt Curve Stage为体系，使用CFX96 Touch实时定量PCR仪进行定量聚合酶链反应。使用GAPDH作为内参，反应使用的正向、反向引物序列，见表1。采用?2???Cq方法计算目的基因的相对表达量。

2.5 Western Blot法检测各组软骨细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表达 将各组总蛋白提取后，进行定量、变性。随后配胶，每孔20 μL上样后，按20 V 10 min、80 V 30 min、110 V 60 min条件进行电泳;用激活的PVDF膜转膜后室温摇床封闭1 h，4?C摇床孵育一抗GAPDH（1∶10000）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1000）、Beclin 1（1∶2000）过夜;TBST荡洗后室温摇床孵育二抗1 h，随后滴加ECL发光液进行显影操作，最后Image Lab分析条带进行统计分析。

2.6 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以表示，符合正态分布采用One-way ANOVA方差分析，方差齐组间比较采用LSD法，方差不齐则采用Games-Howell法;不符合正态分布采用Kruskal-Wallis Test非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各代软骨细胞形态观察 原代软骨细胞经质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶消化，差数贴壁纯化培养，倒置显微镜镜下可见：原代软骨细胞培养1 d时，细胞数量较少，形态不规则，细胞成簇成团贴壁向周围生长，见图1（1）。原代软骨细胞培养8 d时，细胞数量增多，形态为圆形和椭圆形，见图1（2）。原代细胞经传代培养为第1代软骨细胞时，传代后杂质细胞减少，生长速度加快，贴壁时间缩短，约5 d可以铺满皿底，见图1（3）。第2代软骨细胞形态较规则，以圆形及椭圆形为主，胞核清晰，胞浆丰富，边缘清晰，呈典型的“铺路石”状，第2代软骨细胞分裂迅速和第1代软骨细胞相比又有所提升，约3 d铺满皿底，见图1（4）。因后续传代培养的第3代[见图1（5）]、第4代[见图1（6）]软骨细胞经传代部分会分化为肥大细胞，生长速度减慢且细胞形态边界不清，故选择细胞生长速度快、形态最佳的第2代软骨细胞进行后续实验研究。

3.2 软骨细胞鉴定结果 选择第2代软骨细胞进行甲苯胺蓝染色。甲苯胺蓝染色后软骨细胞胞浆呈现深蓝色，胞核呈紫色，细胞整体呈蓝紫色。见图2。

3.3 CCK-8法检测荣筋拈痛方对软骨细胞活性的影响 与空白对照组比较，模型对照组的细胞活力显著降低（P < 0.01），而与模型对照组比较，荣筋拈痛方低、中、高剂量组细胞活力均显著提高，呈剂量依赖性增加（P < 0.01）。见表2。

3.4 各组软骨细胞LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表达情况 与空白对照组比较，模型对照组LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA表达水平升高（P < 0.05或P < 0.01）;与模型对照组比较，荣筋拈痛方中、高剂量组LC3Ⅱ的mRNA表达水平降低（P < 0.01），荣筋拈痛方低、中、高剂量组Beclin 1的mRNA表达水平降低（P < 0.01）。见表3。

3.5 各组软骨细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的蛋白表达比较 与空白对照组比较，模型对照组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表达水平升高（P < 0.05或P < 0.01）;与模型对照组比较，荣筋拈痛方中、高剂量组LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达水平降低（P < 0.05或P < 0.01），荣筋拈痛方低、中、高剂量组Beclin 1的蛋白表达水平降低（P < 0.05）。见图3、表4。

4 讨 论

KOA属中医学“骨痿”“骨痹”或“历节风”等范畴，《素问·痹论篇》最早提出“骨痹”这一概念，并认为是风寒湿三气夹杂侵袭人体所致。OA病因病机总属“本痿标痹”，其本为肝肾亏虚，标为风寒湿邪入侵、瘀血阻滞经络。故中医辨证多从风寒湿论治、从肝肾论治及从痰瘀论治[8]，临床常用方剂有当归四逆汤[9]、独活寄生汤[10]、荣筋拈痛方及身痛逐瘀汤[11]等。荣筋拈痛方的补肝肾、壮筋骨、祛风湿和止痹痛功效符合OA痹证日久肝肾两虚的核心病机，是在国医大师陈可冀院士指导下拟出的治疗OA的新组方。该方由牛膝、当归、羌活等药物组成，治疗OA的总有效率、疼痛评分以及症状积分下降程度与对照组独活寄生汤比较，差异无统计学意义（P > 0.05），疗效相当[12]，该方制备方法和用途已获国家发明专利授权[ZL201710284659.8]。郑春松等[3，13]运用计算机模拟探索荣筋拈痛方治疗OA作用靶点时发现，其作用靶点有基质金属蛋白酶-1、IL-1β和肿瘤坏死因子-α，可以通过抑制炎症、抑制分解代谢和刺激合成代谢等方面保护软骨，缓解疼痛。林洁等[5]结合BATMAN-TCM预测分析荣筋拈痛方对OA的作用及靶点和动物实验，初步验证荣筋拈痛方能够治疗OA。

自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是细胞对各种压力的反应，细胞器和大分子被吞噬分解参与体内循环以维持细胞代谢稳态，即细胞的“自我吞噬”过程[14]。自噬又是一把“双刃剑”，可能在软骨细胞中同时发挥细胞保护和促进死亡的作用[15]。而这可能取决于细胞应激的类型，当在炎症[16]、缺氧[17]等条件下，可诱导细胞自噬性死亡，自噬也被报道在内质网应激等应激下细胞发挥存活作用[18]。但同时又有研究表明，自噬是有益还是有害取决于炎症、氧化应激[19]等刺激的程度和持续时间[20]。故保持高水平的自噬可能发挥对软骨的保护作用;但在某些条件下，过度自噬却可能造成软骨细胞的损伤，诱发或加重KOA。

在自噬激活的过程中，Beclin1和LC3是自噬激活的可靠生物标记物，其中Beclin1是酵母自噬基因Atg/Vps30的同源基因，其表达强度与自噬的激活密切相关，Beclin1表达上调是自噬过程激活的必要条件[21]。LC3是Atg8蛋白的一个同源体，也是目前研究最广泛的一个自噬标记蛋白。LC3蛋白的主要功能是磷脂化，在细胞中有两种剪切类型，即LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，其中LC3Ⅰ主要定位在细胞质中，LC3Ⅱ则主要定位在自噬小体膜结构上。当自噬形成时，LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ，并与自噬小泡结合，故LC3Ⅱ数量与自噬形成的程度呈正相关，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率通常用于评估自噬水平[22]。Beclin1表达与自噬体的形成和成熟有关，与自噬水平呈正相关，是自噬的正向调节因子。本研究检测了大鼠软骨细胞的自噬相关蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平，结果显示，在10 ng·mL-1 IL-1β刺激24 h后，模型对照组自噬水平明显增加;而给予荣筋拈痛方干预后，自噬水平显著下降。提示IL-1β的炎癥刺激可增加自噬相关蛋白的表达;而荣筋拈痛方可能是通过抑制自噬水平，使自噬恢复动态平衡，从而达到改善软骨细胞炎症情况。

综上所述，100 μg·mL-1荣筋拈痛方对于缓解IL-1β诱导的软骨细胞过度自噬效果显著，荣筋拈痛方可以抑制KOA的进展，其机制可能与自噬有关。自噬是一个动态的过程，未来的研究可通过检测荣筋拈痛方对不同KOA阶段软骨细胞自噬水平的影响，进一步阐明荣筋拈痛方的抗KOA机制，为KOA的防治提供理论依据。

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收稿日期：2021-10-16;修回日期：2021-12-08