外周血Septin9 基因甲基化和血清CA199联合检测在结直肠癌筛查中的诊断价值*

穆剑强，高海锋

1.云南新昆华医院检验科，云南昆明 655600；2.陕西省宝鸡市中心医院检验科，陕西宝鸡 721008

结直肠癌(CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率居恶性肿瘤的第3位，且发病率呈逐年上升的趋势[1-2]。但是，约80%的CRC患者被诊断时病情已发展至中晚期[3]，给患者带来巨大的身心痛苦和经济压力。目前，CRC 筛检手段种类繁多，且各有优劣，主要包括粪便潜血试验(FOBT)、结直肠镜检查、病理活检等。FOBT检测结果不稳定，灵敏度及特异度都比较低；结直肠镜是侵入性检查，易造成肠穿孔、肠道感染等并发症，不易被患者接受；病理活检是确诊CRC的金标准，但属于有创操作，不易被患者采纳，甚至有感染的风险，不适用于普查。研究表明，外周血中 Septin9 基因的甲基化检测诊断CRC的准确性较高，是一种可靠的诊断指标[4-6]。因此，本研究将Septin9 基因甲基化与传统标记物CA199进行联合检测，探讨二者联合检测对CRC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年8月至2020年8月云南新昆华医院收治的202例结直肠病变患者的病历资料，以结直肠镜病理诊断为金标准，确诊CRC患者93例(CRC组)，其中男60例、女33例，年龄35～81岁、平均(60.72±14.24)岁；结直肠息肉患者109例(结直肠息肉组)，其中男72例、女37例，年龄33～83岁、平均(61.11±13.87)岁。同时选择同期体检健康者50例作为对照组，其中男35例、女15例，年龄35～80岁、平均(60.12±13.84)岁。各组研究对象年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。参与本研究的对象均自愿签署知情同意书，研究方案经云南新昆华医院伦理委员会批准后实施。

1.2方法

1.2.1标本采集 Septin9基因甲基化检测标本的采集使用专用EDTA-K2抗凝管，抽取受试者外周静脉血10 mL，离心后取3.5 mL血浆保存于-20 ℃冰箱待测。同时抽取受试者外周静脉血3～5 mL于普通促凝管中，用于CA199的测定，离心后取上层血清保存于-20 ℃冰箱待测。

1.2.2项目检测 Septin9基因甲基化检测采用聚合酶链反应(PCR)荧光探针法，试剂盒由北京博尔诚科技有限公司提供。核酸提取采用Smart32核酸提取仪，核酸扩增使用DA7600型实时荧光定量PCR扩增仪，仪器由中山大学达安基因科技有限公司提供。提取及扩增程序严格按照试剂及仪器操作说明进行操作。CA199检测试剂盒、质控品、校准品及Cobas 601全自动化学发光分析仪均由瑞士罗氏有限公司提供。

1.3结果判断 结果判断：扩增循环数(Ct)≤41.0且ACTB内参的Ct≤32.0时结果为阳性；Ct>41.0且ACTB内参的Ct≤32.0时结果为阴性；检测结果满足上述要求，且扩增曲线无异常时结果最终判为有效。CA199的正常参考区间为0～37.0 U/mL，>37.0 U/mL时判定为阳性，否则为阴性。

1.4CRC组治疗 CRC患者分别采用手术治疗和药物化疗，其中手术治疗76例，药物化疗17例。

1.5观察指标 比较CRC组治疗前各组Septin9基因甲基化和血清CA199阳性情况，以及CRC组治疗后Septin9基因甲基化和血清CA199阳性情况。

1.6统计学处理 采用SPSS 24.0统计学软件对数据进行处理。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析Septin9基因甲基化、CA199单项及联合检测对CRC的诊断性能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CRC组治疗前各组Septin9基因甲基化和CA199阳性率的比较 CRC组治疗前，CRC组、结直肠息肉组和对照组Septin9基因甲基化阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=118.35，P<0.001)；CRC组与结直肠息肉组Septin9基因甲基化阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=67.88，P<0.001)；CRC组与对照组Septin9基因甲基化阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=100.44，P<0.001)；结直肠息肉组与对照组Septin9基因甲基化阳性率比较，差异亦有统计学意义(χ2=18.378，P<0.001)。CRC组、结直肠息肉组和对照组CA199阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=84.61，P<0.001)；CRC组与结直肠息肉组CA199阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=48.795，P<0.001)；CRC组与对照组CA199阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=63.97，P<0.001)；结直肠息肉组与对照组CA199阳性率比较，差异亦有统计学意义(χ2=10.984，P<0.001)。见表1。

2.2Septin9基因甲基化和CA199对CRC诊断的性能比较 Septin9基因甲基化、CA199单项检测及联合检测对CRC诊断的性能比较，见表2。联合检测的灵敏度、约登指数和AUC较单项检测高(P<0.05)。

2.3CRC组治疗后Septin9基因甲基化和CA199阳性率 经治疗后，CRC组Septin9基因甲基化阳性率为33.33%(31/93)，CA199阳性率为32.26%(30/93)，与表1中治疗前的Septin9基因甲基化(87.10%)和CA199(72.04%)阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗方式不同，治疗后Septin9甲基化基因和CA199阳性的比例不一致，采用手术治疗的76例患者中，治疗后Septin9基因甲基化阳性率为22.37%(17/76)，CA199阳性率为31.58%(24/76)；采用药物化疗的17例患者中，治疗后Septin9基因甲基化阳性率为82.35%(14/17)，CA199阳性率为35.29%(6/17)。

表1 各组Septin9基因甲基化、CA199阳性率的比较[n(%)]

表2 Septin9基因甲基化、CA199单项检测及联合检测对CRC的诊断性能比较

3 讨 论

CRC是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，调查显示，我国每年CRC新发病例超过25万，死亡病例约14万，均占世界同期CRC病例的20%[7]。CRC早期症状不明显，不易被患者察觉，出现明显症状的CRC患者到医院就诊时，其病情已经发展到中晚期，错过最佳治疗时期，手术5年存活率仅30%～50%[8]。因此，高效的CRC筛查方法可以显著改善患者5年生存率，降低病死率[9]。目前，诊断CRC的方法较多，包括FOBT、常规血清肿瘤标记物筛查、结直肠镜检查、病理活检等，但这些方法灵敏度、特异度较低或为有创检查，不能满足CRC早期诊断和筛查的需求。研究显示，异常DNA 甲基化和蛋白修饰异常引起致癌基因过度表达、抑癌基因表达缺失是CRC发生与发展的重要机制，其中 Septin9 基因甲基化被认为与CRC密切相关[10]。因此，本研究将Septin9基因甲基化和传统肿瘤标记物CA199纳入研究，探讨二者联合检测在CRC筛查中的应用价值。

Septin9基因属于抑癌基因，其甲基化会抑制该基因正常表达，导致细胞分裂异常和癌变，其参与CRC癌变的机制主要包括缺氧诱导因子(HIF)-1信号通路、JNK信号通路、Rho信号通路以及通过影响细胞正常分裂诱导多核细胞产生[11]。在CRC患者体内，由于肿瘤细胞凋亡及坏死，其DNA被释放入外周血，因此在外周血中可检测到异常甲基化的Septin9[12]。本研究结果显示，CRC组外周血Septin9基因甲基化阳性率明显高于结直肠息肉组和对照组(P<0.05)，结直肠息肉组Septin9基因甲基化阳性率显著高于对照组(P<0.05)，表明Septin9基因甲基化在CRC患者中高表达，外周血Septin9基因甲基化检测对诊断CRC具有较好的临床价值。CRC组血清CA199阳性率显著高于结直肠息肉组和对照组，但均较Septin9基因甲基化阳性率低。

本研究进一步对CRC组中Septin9基因甲基化和CA199单项检测和联合检测诊断CRC的性能做了研究，结果显示Septin9基因甲基化诊断CRC的灵敏度为89.32%，较文献[13-14]报道的Septin9基因甲基化检测筛查CRC的灵敏度高，这可能与本研究收集的病例数较少、患者就诊时间点的选择等因素有关。Septin9基因甲基化诊断的约登指数为0.681 1，AUC为0.793，均高于CA199检测的结果，表明Septin9基因甲基化对诊断CRC具有很高的灵敏度和准确度，可成为CRC患者筛查或诊断的实验室指标。血清CA199检测的灵敏度较外周血Septin9基因甲基化低，但特异度较外周血Septin9基因甲基化高，所以可以弥补Septin9基因甲基化诊断中的不足。最后，本研究将两项指标联合进行分析，结果显示，二者联合检测的灵敏度、约登指数和AUC均较单项检测高，表明联合检测较单一指标检测更有优势。通过这种无创的检测方法可以快速地将高危人群筛查出来，进而再对高危人群做进一步的病理组织检查，最大限度地减少有创检查的比例，提高患者依从性，缩短检测周期，节省医疗资源。

最后，本研究将CRC组治疗前后Septin9基因甲基化和CA199阳性率做了统计研究，结果发现，CRC组Septin9基因甲基化和CA199治疗前后阳性率的比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明两项指标对于评估CRC患者治疗后效果具有一定的临床价值。随后，本研究对采用不同治疗方式的患者做了统计，结果显示：采用手术治疗的76例患者中，治疗后Septin9基因甲基化阳性率为22.37%，CA199阳性率为31.58%；采用药物化疗的17例患者中，治疗后Septin9基因甲基化阳性率为82.35%，CA199阳性率为35.29%。这就表明，Septin9基因甲基化检测在手术后的患者中改变明显。CA199对于手术治疗的CRC患者的预后评估价值虽然不及Septin9基因甲基化，但其在药物化疗评估中的变化较采用手术治疗更明显。

综上所述，Septin9基因甲基化和CA199检测具有简便、快速、准确、患者易接受及适用于普查等优点，二者联合检测可以做到优势互补，提高诊断效率，对于CRC的诊断和预后评估具有很高的价值。由于本研究样本量较少，对于外周血Septin9基因甲基化在CRC分期中的诊断价值未做进一步研究，将继续积累病例，将Septin9基因甲基化水平与CRC分期的相关性探索纳入今后的研究中，为CRC分期的诊断提供更可靠的科学依据。