胫骨干骨折骨不连患者外周血Treg细胞频率变化研究*

陈明辉，欧阳正晓，邓件良△

(1.长沙市中心医院骨科，湖南 长沙 410004；2.中南大学湘雅二医院骨科，湖南 长沙 410012)

如何促进骨折后的骨骼愈合、减少骨不连的发生，一直是临床关注的热点问题之一。数据显示，2018年全球骨折发病率约为2%，但因骨折愈合过程十分复杂，尽管严格依照治疗规范进行处理，骨折骨不连的发病率仍高达5%～10%[1]。胫骨干骨折是临床中最常见的长骨骨折类型之一，一般采用手术治疗，但易于发生骨不连，影响患者的生活质量。因此，对胫骨干骨折患者术后的愈合情况进行及时评估及干预十分重要。

骨折的愈合过程复杂，涉及免疫细胞、间充质干细胞及其他多种细胞、细胞信号分子。已有研究显示，T淋巴细胞根据亚群不同，可对骨折愈合起到促进或者抑制作用[2]。其中，调节性T细胞(Treg细胞)作为具有重要免疫调节、免疫抑制功能的T细胞亚群，其数目或功能异常已被证实与多种炎症性疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤相关。此外，免疫系统的T细胞、B细胞、树突状细胞(DC细胞)等都与破骨细胞、成骨细胞具有相互作用[3-4]。因此，作者认为Treg细胞异常可能也在骨折骨不连的过程中发挥了一定作用，对胫骨干骨折骨不连患者Treg细胞频率的变化进行了研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 研究共纳入自2015年5月至2020年8月长沙市中心医院收治的60例胫骨干骨折患者，术后根据胫骨干骨折影像学愈合评分系统(RUST)评分，将患者分为骨折正常愈合组45例，骨折骨不连组15例。此外，纳入45例无骨折者作为健康对照组。骨折正常愈合组中，男25例，女20例，平均年龄(41.7±5.9)岁，平均体重(64.55±11.34)kg，平均受伤至手术时间为6.3 d。骨折骨不连组中，男9例，女6例，平均年龄(42.1±6.1)岁，平均体重(63.87±10.91)kg，平均受伤至手术时间为6.4 d。健康对照组中，男23例，女22例，平均年龄(41.9±5.5)岁，平均体重(64.10±10.25)kg。3组在年龄、性别、体重等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)年龄大于或等于18岁；(2)单纯外伤导致的单侧胫骨干骨折，经临床体征与影像学检查确诊；(3)研究获得医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。排除标准：(1)骨质疏松症、骨肿瘤、骨结核等疾病导致的病理性骨折；(2)患有恶性肿瘤、自身免疫性疾病；(3)长期使用糖皮质激素或其他免疫抑制剂药物；(4)患有精神疾病或者其他身体器官严重疾病。

1.2方法 入院后，对患者进行血常规、大小便常规、心电图、胸部X线片、X线、计算机断层扫描(CT)等检查。根据患者病情，对骨折采用外固定架、钢板或髓内钉固定，必要时行自体骨移植。术后第1、2、4、8、12、16、20、24周复查，采用RUST评估患者胫骨干骨折愈合情况。若第24周RUST评分大于或等于7分，且骨折处无压痛、无异常移位，评定为骨折正常愈合，否则评定为骨折骨不连。于术前和术后1、4、24周分别采集各组受试者3～5 mL外周静脉血标本，室温下以2 000 r/min离心30 min，在无制动状态下自然停止，收集外周血单个核细胞(PBMC)，随后洗涤PBMC2次，加入抗CD4-APC-Cy7、抗CD25-PE荧光抗体，流式表面荧光抗体标记染色20 min。洗涤PBMC2次，用Fix/Perm液及Perm液处理30 min；洗涤1次，加入抗FOXP3-Alexa Fluor-488荧光抗体，流式胞内荧光抗体染色60 min。洗涤后，立即用流式细胞仪检测CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞数量。流式荧光抗体均购于美国Biolegend公司，流式细胞仪为美国BD公司的FACSCanto Ⅱ流式细胞仪。

2 结 果

术前，健康对照组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞频率(Treg细胞占CD4+T细胞比例)为(4.28±1.35)%，骨折正常愈合组Treg细胞频率为(7.53±2.21)%，骨折骨不连组Treg细胞频率为(6.29±1.74)%。健康对照组Treg细胞频率低于骨折正常愈合组及骨折骨不连组，差异均有统计学意义(P<0.05)。术后1、4周，骨折骨不连组及骨折正常愈合组Treg细胞频率较术前均呈升高趋势，健康对照组Treg细胞仍低于骨折骨不连组及骨折正常愈合组，差异均有统计学意义(P<0.05)。术后4周，骨折正常愈合组Treg细胞频率明显高于骨折骨不连组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后24周，3组间Treg细胞频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3 讨 论

胫骨干骨折是临床常见的骨折，约占全身骨折的12%。由于骨折后局部血运变差、胫骨的开放性及感染等因素，患者术后常发生骨折延迟愈合，甚至骨不连等严重并发症，发病率高达48%[5]。骨不连患者常需经历多次反复手术及长时间的后续治疗，患者患处的疼痛、功能障碍，以及反复外科治疗不仅给患者带来了巨大的躯体痛苦和心理压力，也会给患者家庭造成沉重经济负担[6]。因此，骨不连一直是骨科领域的重点和难点问题。解剖复位、坚固固定、促进骨折愈合、加强成骨能力均是骨不连治疗的关键。骨折愈合过程涉及骨细胞、破骨细胞、成骨细胞等的增殖、分化，免疫细胞也参与骨折后骨再生的调节。骨折时常伴随发生周围组织及血管系统损伤，继而引发局部炎性反应，形成血肿[7]。骨折局部及血肿周围的高浓度促炎性因子可吸引、募集各种免疫细胞，包括中性粒细胞、巨噬细胞、间充质干细胞等。巨噬细胞在炎性环境下分化为促炎性M1表型，进一步激活获得性免疫反应，特别是激活T淋巴细胞。动物实验结果表明，T细胞减少影响成骨细胞成熟，导致骨质矿化延缓，缺乏T细胞的大鼠骨折后骨质修复及骨重建均显著减缓[8-9]。Treg细胞是一类重要CD4+T细胞亚群，具有免疫调节功能，其经典表型为CD4+CD25+FOXP3+。Treg细胞的经典免疫调节作用包括抑制自身反应性T细胞活动，诱导建立免疫耐受，以及抑制炎性反应。Treg细胞可促进成骨细胞并抑制破骨细胞活动[10]。此外，Treg细胞可通过分泌转化生长因子-β、白细胞介素-10等经典的抗炎性细胞因子，以调节促炎性Th1细胞的活动，或诱导抗炎性miRNA的表达，从而抑制骨折局部炎性反应[11-12]。

本研究中采用流式细胞学技术对胫骨干骨折患者外周血的Treg细胞频率进行了动态检测，结果显示，术前和术后1、4周，骨折正常愈合组及骨折骨不连组Treg细胞频率均高于健康对照组，且随时间进展呈升高趋势，提示Treg细胞在骨折后参与骨质修复与重建。值得注意的时，术后4周，骨折正常愈合组Treg细胞频率明显高于骨折骨不连组。术后24周，3组间Treg细胞频率未再观察到显著差异。以上结果表明，骨折骨不连患者在骨折后早期，Treg细胞比例低于正常愈合患者，Treg细胞不足可能导致成骨细胞活动受抑及局部炎症清除障碍，从而引起骨折骨不连。