帕金森病患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平变化及临床意义

白雪，董巧云，王博，赵丽，姚彦

沧州市中心医院神经内五科，河北沧州061000

帕金森病(PD)是中老年人常见的神经系统变性疾病，主要表现为认知障碍、精神障碍、自主神经功能障碍等非运动症状，以及姿势平衡障碍、动作迟缓、震颤等运动障碍，随着病情进展运动症状和非运动症状会持续加重，造成了巨大的社会和医疗负担[1]。研究表明，神经细胞凋亡是PD发生的关键病理生理机制[2]。微小RNA(miRNA)是一种单链非编码内源性RNA分子，能调控靶基因表达，参与神经元增殖、分化、凋亡等生理病理过程[3]。研究报道，miR-103a-3p能靶向脑源性神经营养因子调控阿尔茨海默病神经元增殖、分化、凋亡，参与阿尔茨海默病进展[4]。另有研究报道miR-486-5p是神经发生的调节剂[5]。目前关于血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平与PD的关系研究报道较少，本研究旨在分析PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平变化，探讨二者对PD的诊断价值，以期为临床诊治PD提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年7月—2021年1月我院收治的183例PD患者为PD组，其中男112例，女71例；年龄31～88(62.22±8.87)岁；体质量指数18～28(23.40±2.05)kg/m2。纳入标准：符合《中国帕金森病的诊断标准(2016版)》[6]诊断标准；初次确诊，未接受任何治疗；病历资料完整；患者及家属均知情研究。排除标准：明确脑外伤史；化学药物、创伤等诱发的PD；合并免疫、血液系统疾病；合并严重心、肝、肾功能障碍；合并严重感染；近期服用激素类抗炎药物。另选取同期75例健康体检者为对照组，其中男46例，女29例；年龄43～75(60.52±7.61)岁；体质量指数18～28(23.47±2.09)kg/m2。两组一般资料比较差异无统计学意义。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 血清miR-103a-3p、miR-486-5p检测 采集PD组入院后次日和对照组体检时空腹静脉血，3 000 r/min离心10 min(离心半径10 cm)，分离血清于-80 ℃冰箱中保存至检测。TRIzol试剂盒提取血清总RNA，TaKaRa试剂盒转录合成cDNA，Narodrop验证cDNA浓度及纯度，使OD260/OD280为1.8～2.0，进行PCR扩增。miR-103a-3p正向引物：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，反向引物：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；miR-486-5p正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；内参U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反应体系(20 μL)：1 μL cDNR、1 μL上游引物、2 μL上游引物、10 μL SYBR Green Master Mix、6 μL ddH2O。反应条件：95 ℃ 30 s(1个循环)，95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s(40个循环)。采用2-ΔΔCt法计算血清miR-103a-3p、miR-486-5p相对表达量。

1.3 病情分级 PD患者入院后12 h内参考Hoehn-Yahr分级评估PD严重程度。Hoehn-Yahr分级由HOEHN等[7]于1967年编制，分为0级、1级、1.5级、2级、2.5级、3级、4级、5级。0级：无PD症状；1～2级：轻度PD；2.5、3级：中度PD；4、5级：重度PD。根据Hoehn-Yahr分级将PD患者分为重度组(n=53)、中度组(n=71)、轻度组(n=59)。

2 结果

2.1 两组血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平比较 PD组血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平低于对照组(P均<0.001)。见表1。

表1 两组血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平比较

2.2 不同病情PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平比较 轻度组、中度组、重度组血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平依次降低(P均<0.05)。见表2。

表2 不同病情PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平比较[M(P25,P75)]

2.3 PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平与Hoehn-Yahr分级的相关性 PD组患者Hoehn-Yahr分级为3.00(2.00,4.00)，Spearman相关性系数显示，PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平与Hoehn-Yahr分级均呈负相关(rs分别为-0.865、-0.815，P均<0.001)。

2.4 血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平对PD的诊断价值 ROC曲线显示，miR-103a-3p+miR-486-5p诊断PD的AUC大于miR-103a-3p、miR-486-5p单独诊断(Z分别为3.089、3.293，P=0.002、0.001)。见表3。

表3 血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平对PD的诊断价值

3 讨论

PD是一种以黑质多巴胺能神经元进行性退变和路易小体形成为主要病理变化的多系统受累神经系统变性疾病，其患病率随着年龄增长而升高，我国>65岁人群PD患病率为1.7%，预计到2020年病例将增加至500万[8]。PD早期诊断有助于延缓病情进展，改善运动症状和非运动症状，目前临床主要依靠患者临床表现，尚缺乏特异性指标，而当患者出现明显症状时，已出现严重神经元损伤，故探索其生物标志物至关重要。

miRNA是一类长度为19～25 nt的内源性非编码RNA，可通过与靶基因mRNA的3′非翻译区部分或完全匹配结合，介导靶基因翻译抑制或降解，进而调控靶基因的表达，与PD发生发展密切相关[9]。如miR-1301-3p能靶向间隙连接蛋白β1，通过抑制α-突触核蛋白介导的核苷酸结合寡聚结构域、富含亮氨酸重复序列和含Pyrin结构域3的激活抑制PD进展[10]。miR-421能靶向肌细胞增强因子2D加重神经毒性并促进细胞死亡进而促进PD进展[11]。miR-103a-3p位于人染色体5q34，近年多项研究均报道miR-103a-3p参与神经系统疾病发生，如HE等[12]研究显示，神经胶质瘤组织和细胞中miR-103a-3p表达下调，上调miR-103a-3p表达能靶向Zic4抑制神经胶质瘤血管生成，抑制其恶性行为。LIGUORI等[13]通过高通量下一代测序分析发现，miR-103a-3p在肌萎缩侧索硬化患者外周血中低表达。CHANG等[14]通过全基因组分析发现，miR-103a-3p在阿尔茨海默病中表达下调。但关于miR-103a-3p与PD的关系尚不明确。本研究显示，PD组血清miR-103a-3p水平低于对照组，提示miR-103a-3p低表达可能参与PD发生。进一步分析显示，轻度组、中度组、重度组血清miR-103a-3p水平依次降低，与Hoehn-Yahr分级呈负相关，说明血清miR-103a-3p低表达与PD发展和进展密切相关。其机制可能与miR-103a-3p能靶向钙调蛋白1抑制神经元细胞凋亡有关。神经细胞凋亡是PD的主要病理生理机制，钙调蛋白1是一种能与钙离子结合的多功能蛋白质，参与神经元死亡与存活的调节。近年多项研究均表明钙调蛋白1高表达是氧化应激、致线粒体功能障碍等因素促进神经退行性变的重要原因[15-16]。徐向玲等[17]研究显示，上调miR-103a-3p表达能靶向钙调蛋白1减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的PD细胞凋亡。研究[18]也表明，运动上调血清miR-29a-3p水平具有改善PD患者认知功能作用，进一步证实了本研究结果。

miR-486-5p位于人染色体8p11.21，既往研究多报道其与肿瘤的关系，如miR-486-5p在非小细胞肺癌血清中水平高，能靶向细胞黏附分子1/紧密连接轴促进非小细胞肺癌细胞转移[19]。miR-486-5p在胃癌细胞中低表达，能靶向卵泡抑素样蛋白3抑制胃癌细胞活力、增殖和迁移[20]。近年DORI等[5]通过分析与神经发生和大脑发育相关miRNA发现，miR-486-5p是神经发生和大脑发育的调节剂，提示miR-486-5p可能参与神经系统疾病。近年研究认为，PD可能起源于肠道，其机制涉及肠道渗透性增加、氧化应激水平升高、α-突触核蛋白由肠道向脑传播等[21]。近期KURZ等[22]通过结肠活检和Illumina高通量测序分析PD患者肠道miRNA发现，PD患者肠黏膜中miR-486-5p表达上调。但本研究结果显示，PD组血清miR-486-5p水平低于对照组，与KURZ等[22]报道的miR-486-5p在PD患者中表达上调存在差异，这可能与检测样本不一样有关。在非小细胞肺癌中，血清miR-486-5p水平高，癌组织中miR-486-5p低表达，且血清高水平miR-486-5p与患者生存不利相关，癌组织中miR-486-5p低表达则能作为肿瘤抑制因子抑制非小细胞肺癌转移[19]。因此有关miR-486-5p在PD血清与肠道中的表达还需进一步研究。本研究进一步分析显示，轻度组、中度组、重度组血清miR-486-5p水平依次降低，与Hoehn-Yahr分级呈负相关，说明血清低水平miR-486-5p参与PD发展和进展。其机制可能与miR-486-5p能靶向瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员2(TRPM2)抑制神经元细胞凋亡有关。瞬时受体电位离子通道是外周和中枢神经系统广泛分布的通道蛋白，TRPM2为瞬时受体电位离子通道家族典型成员，异常激活可引起神经细胞内Ca2+积累，促进细胞死亡，是PD发生的关键因素[23-24]。彭秀华等[25]研究显示，上调miR-486-5p表达能靶向TRPM2抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的PD细胞凋亡和自噬。

本研究通过ROC曲线分析显示，血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平均可作为PD诊断指标，且miR-103a-3p+miR-486-5p诊断PD的AUC为0.868，大于二者单独诊断，说明联合检测能提升PD诊断价值，有助于发现更多PD高风险人群。

综上所述，miR-103a-3p、miR-486-5p在PD患者血清中水平低，与PD病情进展密切相关，可作为PD诊断指标。但miR-103a-3p、miR-486-5p对PD相关影响机制还需进一步深入研究。