吴元芳,张陈丽,张芹
安徽中医药大学第一附属医院药剂科,合肥230031
原发性肝癌(PLC)是常见的恶性肿瘤,具有隐匿性、进展快、易转移、预后差等特点,位居我国恶性肿瘤致死的前列[1]。中医药治疗PLC具有独特优势,从中药中提取有效的抗肿瘤成分是研发抗癌药物的重要途径。新近研究证实,白花蛇舌草是国内外抗肿瘤中药的研究热点之一[2-3]。既往研究表明,白花蛇舌草乙醇提取物中的槲皮素、熊果酸以及豆甾醇等有效成分能够通过抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、参与肿瘤免疫等途径发挥抗肿瘤活性[4-5]。在荷瘤小鼠肝癌模型中,中药白花蛇舌草能够增强小鼠免疫力,从而清除肿瘤细胞,抑制肿瘤血管生成[6]。另外,研究发现白花蛇舌草有效活性成分能够抑制人肝癌细胞HepG2增殖,其机制与调控CDK2-E2F1 mRENA表达,阻止G0/G1期相关[7],但其对PLC大鼠肝癌细胞增殖的调控机制尚不清楚。研究显示,PI3K/Akt信号通路的激活可促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[8]。盘状结构域受体1(DDR1)是一种非整合素胶原受体,为酪氨酸激酶蛋白家族成员之一,广泛参与细胞增殖、凋亡[9]。文献报道,DDR1能够促进肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞上皮间质转化,参与PLC进展,其机制与激活PI3K/Akt信号通路有关[10]。2019年12月—2020年11月,本研究拟通过小剂量二乙基亚硝铵(DEN)诱导构建肝癌大鼠模型,探究白花蛇舌草乙醇提取物对肝癌大鼠肿瘤细胞增殖的影响及其作用机制,以期为白花蛇舌草乙醇提取物用于临床治疗PLC提供更多的基础研究数据。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选取雄性、SPF级、体质量180~200 g、周龄6~8周Wistar大鼠82只。实验动物由安徽医科大学实验动物学部提供[合格证号:SCXK(皖)2017-001],该实验通过了动物实验医学伦理委员会批准(批准号:201907008)。
1.1.2 药物与实验试剂 白花蛇舌草乙醇提取物由安徽医科大学药学院提供;DDR1兔单克隆抗体、PI3K小鼠单克隆抗体、Akt小鼠单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology;HE染色液、PCNA小鼠单克隆抗体、β-actiin小鼠单克隆抗体、一抗稀释液、二抗稀释液、山羊抗小鼠、山羊抗兔、极超敏ECL发光试剂盒均购自江苏碧云天生物技术公司。
1.1.3 实验仪器 G22-W型高速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司);SuPerMax 3000FA型多功能酶标仪(Thermo赛默飞世尔);M371450型组织涡旋仪(武汉维塞尔生物科技有限公司);TC-XDS-500C型荧光倒置显微镜(日本/奥林巴斯Olympus);Western blotting检测装置、GoodLook-1000型成像系统(美国Bio-Rad伯乐公司)。
1.2 方法
1.2.1 PLC模型构建 选取82只Wistar大鼠,腹腔注射DEN(50 mg/kg),连续16周,每周3次,构建PLC模型[9]。取上述2只大鼠颈椎脱臼处死,病理学检测肝癌造模成功与否。若大鼠肝组织细胞出现明显的形态学改变,细胞核变大,排列紊乱并伴有细胞坏死以及炎症细胞浸润等情况则表明建模成功。
1.2.2 动物分组及给药处理 将PLC造模成功的大鼠随机分为4组,即模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组20只。各组大鼠于造模成功后1 d给予干预,其中后三组分别给予90、180、360 mg/(kg·d)白花蛇舌草乙醇提取物灌胃处理8周,模型组给予乙醇提取物溶剂1 mL/(100 g·d)灌胃处理8周。观察各组大鼠一般情况。
1.2.3 样本采集 待各组大鼠灌胃处理8周后,各组随机选取6只大鼠,腹腔麻醉,腹主动脉取血3 mL,3 000 r/min离心10 min(离心半径6 cm),放置于-20 ℃冰箱保存留用。待血液采集后,剪取大鼠肝脏组织,一部分放置于-80 ℃冰箱保存,一部分放置于4%的多聚甲醛内保存。
1.2.4 血清ALT和AST水平检测 全自动血清生化仪检测各组大鼠血清ALT、AST水平。
1.2.5 肝组织形态学变化观察 采用4%的多聚甲醛固定各组大鼠肝组织,脱水、透明、包埋、石蜡切片,并按照HE染色试剂盒进行肝组织染色,显微镜下观察大鼠肝组织形态学变化。
1.2.6 肝组织PCNA蛋白检测 采用免疫组化。60 ℃烤箱切片常规脱蜡,常规脱水后按照免疫组化检测试剂盒行PCNA蛋白染色,DAB显色,显微镜下拍照,并采用Image J软件定量分析大鼠肝组织PCNA蛋白阳性表达情况。PCNA阳性表达率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.2.7 肝组织PI3K、Akt、DDR1蛋白检测 采用Western blotting法。将肝组织碾磨,裂解;BCA法测定蛋白质浓度;凝胶电泳;湿转转膜;上样;用5%脱脂牛奶室温封闭2 h,孵育对应PI3K小鼠单克隆抗体(1∶1 000),Akt小鼠单克隆抗体(1∶1 000),DDR1兔单克隆抗体(1∶500)以及β-actin小鼠单克隆抗体(1∶2 000),4 ℃过夜,孵育对应的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1∶5 000)1~2 h;摇床摇晃上加TPBS洗涤3次,5 min/次,然后加入显影液,显影并拍照。PI3K、Akt、DDR1蛋白表达以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值比值表示。
模型组大鼠精神表现萎靡、毛发散乱,饮食量降低,存活率为80%;低、中、高剂量组大鼠上述状态得到一定的改善,存活率为100%。
2.1 各组血清ALT和AST水平比较 见表1。
表1 各组血清ALT和AST水平比较
2.2 各组肝组织形态学变化 HE染色结果显示,模型组大鼠肝组织细胞出现明显的形态学改变,细胞核变大,排列紊乱并伴有细胞坏死以及炎症细胞浸润等情况;低、中、高剂量大鼠肝组织细胞变形程度减轻,仅伴有少量的细胞坏死以及炎症细胞浸润(图1)。
图1 各组肝组织形态学变化(HE染色)
2.3 各组肝组织PCNA及PI3K、Akt、DDR1蛋白表达比较 见表2。
表2 各组肝组织PCNA及PI3K、Akt、DDR1蛋白表达比较
白花蛇舌草是一种来源于茜草科耳草属植物白花舌草的带根全草,其功效主要包括清热解毒、消痈散结、活血化瘀、抗机体炎症、增强机体的免疫活性等。既往研究证实,白花蛇舌草主要含有环烯醚萜类物质等20多种中药单体活性成分。其中白花蛇舌草有效活性成分多糖、熊果酸以及齐墩果酸等具有显著的抗恶性肿瘤活性[11-12]。还有研究发现,白花蛇舌草乙醇提取物作用于宫颈癌细胞能够显著抑制宫颈癌细胞增殖[13]。另外,动物实验也证实白花蛇舌草对耐药大肠癌细胞的抑制效果明显升高,能够上调Caspase-3促进肿瘤细胞凋亡[14]。以上研究均表明白花蛇舌草能够发挥抗肿瘤活性。手术是PLC目前最有效的治疗方案,但多数患者确诊时已处于晚期,失去了手术机会。同时肝癌患者放化疗的并发症较多且复发、转移率高,因此临床仍缺少理想的治疗手段。为此,积极探寻PLC的发病机制并给予药物干预治疗尤为重要。既往研究证实肝癌细胞凋亡和增殖的失衡是造成PLC恶化的重要原因[15]。中医药治疗PLC具有良好的效果。研究也发现白花蛇舌草乙醇提取物能够通过抑制肝癌细胞增殖,促进细胞凋亡进而发挥抗肿瘤活性[16]。另外,网络药理学筛选显示白花蛇舌草有效活性成分可以通过多途径多靶点的方式发挥抗肝癌的作用[17]。但是既往研究有关白花蛇舌草对肝癌的作用机制尚不完全清楚。结果显示,与模型组大鼠相比,白花蛇舌草乙醇提取物低、中、高剂量组大鼠血清ALT和AST水平均明显降低,肝组织形态学损伤得到明显改善,初步表明白花舌草乙醇提取物能够改善大鼠肝癌病理状态,与以往研究结果一致[18]。
PI3K/Akt信号与肿瘤细胞增殖密切相关[19]。其中Akt是PI3K/Akt信号传导的关键分子,活化Akt能够通过作用于下游多种效应分子而发挥生物学作用。既往研究表明与癌旁组织相比,肝癌组织PI3K、Akt蛋白表达均上调[20]。在体外培养肝癌细胞系HepG2中,PI3K抑制剂LY294002能够抑制PI3K/Akt信号活化,促进细胞凋亡[21]。本实验研究发现,与模型组相比,白花蛇舌草乙醇提取物低、中、高剂量组大鼠肝组织PCNA阳性细胞表达率显著降低,PI3K、Akt蛋白表达亦显著降低。DDR1是一类与肿瘤密切相关的受体酪氨酸蛋白激酶受体,参与了肿瘤细胞的增殖、迁移以及凋亡等过程[22]。既往研究证实DDR1能够通过激活PI3K/Akt信号通路,促进抗凋亡蛋白Bcl-xL表达,抑制人乳腺癌和结肠癌细胞凋亡[23]。另外,DDR1能够通过调控Ras/Raf/ERK信号和PI3K/Akt信号通路增加前列腺癌细胞化疗敏感性[24]。因此,笔者推测在PLC大鼠模型中白花蛇舌草乙醇提取物可能通过调控DDR1,抑制PI3K/Akt信号活化,从而改善PLC大鼠病理损伤。因此,本研究通过Western blotting法检测白花蛇舌草乙醇提取物对大鼠肝癌组织DDR1表达的影响。结果显示与模型组相比,白花蛇舌草乙醇提取物能够下调DDR1表达。以上研究结果初步揭示了白花蛇舌草乙醇提取物对大鼠肝癌细胞增殖的调控作用。但是有关白花蛇舌草乙醇提取物是如何通过影响DDR1进而调控PI3K/Akt尚不清楚。
综上可见,白花蛇舌草乙醇提取物能够抑制大鼠肝癌细胞增殖,其机制可能与下调DDR1表达,抑制PI3K/Akt信号通路有关。