清利塞鼻洗液处方药材中有效成分提取工艺研究*

蓝 伟，胡玉良，曾聪彦

（广州中医药大学附属中山中医院，广东 中山528400）

清利塞鼻洗液源于中山市中医院经验方，由辛夷、白芷、广藿香、鱼腥草等9味中药材组方，可用于鼻内镜术后的鼻腔冲洗，能促进鼻腔、鼻窦黏膜形态和功能的恢复。目前，清利塞鼻洗液的提取工艺为水煎煮提取，而鱼腥草、广藿香和薄荷药材的挥发油含量高，有效成分易损失，故有必要对其现有提取工艺进行改良。辛夷和白芷具有祛风散寒、宣肺通窍之功效，其提取物木兰脂素和欧前胡素的含量将直接影响制剂的质量和疗效。本研究中采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，药渣再与其余药味进行水提取［1］，并对主要工艺参数进行正交优选，筛选出最佳提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技＜中国＞有限公司）；BS224S型电子天平（赛多利斯斯泰迪＜北京＞有限公司，精度为0.1 mg）；HWS-12型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；东方A型电热恒温干燥箱、挥发油提取装置（广州东方电热干燥设备有限公司）；HX64268446 型薄层普通调温电热套层析硅胶板（上海默克化工技术有限公司，规格为10 cm×20 cm）；YH型调温电热套（江苏建湖县近湖镇教学仪器厂）。

1.2 试药

木兰脂素对照品（批号为110882-201909，含量≥95%），欧前胡素对照品（批号为110826 - 201918，含量≥98%），广藿香对照药材（批号为121135-200503），鱼腥草对照药材（批号为121046 - 200904），薄荷对照药材（批号为120916 - 201109），均购自中国食品药品检定研究院；其余试剂均为分析纯，水为超纯水；辛夷、白芷、薄荷等9 味药材均购自广州致信药业股份有限公司，药材信息见表1。

表1 药材信息Tab.l Information of medicinal materials

2 方法与结果

2.1 木兰脂素和欧前胡素含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Simpsil C8柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～30 min时36%A，45 min时75%A，50 min时80%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

取木兰脂素对照品0.024 12 g，精密称定，加甲醇溶解并定容至25 mL；取欧前胡素对照品0.003 5 g，精密称定，加甲醇溶解并定容至100 mL；精密吸取上述溶液各5 mL置10 mL容量瓶中，摇匀，制成木兰脂素、欧前胡素质量浓度分别为482.4，17.5 μg/mL的混合对照品贮备液；精密量取5 mL，加甲醇定容至20 mL，即得木兰脂素、欧前胡素质量浓度分别为120.6 μg/ mL 和4.375 μg/ mL 的混合对照品溶液。取样品20 mL，加乙酸乙酯，提取2 次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至5 mL，充分混匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。取除辛夷、白芷以外的药材样品，按清利塞鼻洗液制备工艺制成阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：取2.1.2 项下3 种溶液各10 μL，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同位置处有相应吸收峰，且阴性对照无干扰，详见图1。

线性关系考察：取2.1.2项下混合对照品贮备液适量，用甲醇稀释成木兰脂素质量浓度为30.15，60.30，120.60，241.20，482.40 μg/ mL，欧前胡素质量浓度为1.093 75，2.187 5，4.375，8.75，17.5 μg/mL 的系列混合对照品溶液；精密量取10 μL，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各成分的质量浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，木兰脂素为Y1= 23.753 76X1- 134.55（R2=0.999 8，n=5），欧前胡素为Y2=53.062 73X2-4.791 67（R2= 0.999 8，n= 6）。结果表明，木兰脂素和欧前胡素质量浓度分别在30.15～482.4 μg/ mL 和1.093 75～17.5 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取2.1.2项下混合对照品溶液10 μL，按2.1.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果木兰脂素和欧前胡素峰面积的RSD分别为0.95%和0.97%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.1.2 项下供试品溶液适量，室温下分别于0，5，10，15，24 h 时按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果木兰脂素和欧前胡素峰面积的RSD分别为0.38%和1.49%（n= 5），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批样品，共6 份，各20 mL，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果木兰脂素和欧前胡素平均含量的RSD分别为1.01%和0.69%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批样品，共6份，各10 mL，分别精密加入已知含量的混合对照品溶液1 mL，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2 挥发油提取工艺优化

正交试验：挥发油提取以加水量（因素A）、浸泡时间（因素B）、提取时间（因素C）为考察因素，以挥发油量为评价指标进行L9（34）正交试验［2-7］。结果见表3 至表5。由表4 可见，提取时间是出油量的主要影响因素，最佳工艺可初步确定为A2B3C2或A3B3C2。由表5可见，三因素对提取结果均无显著影响，故根据挥发油量采取加10 倍量水、浸泡60 min、提取3 h 的方案，此时的出油量较高，加水量对出油量影响不大，故挥发油最佳提取方案为A2B3C2。

表3 挥发油提取工艺优化因素水平Tab.3 Factors and levels of extraction process of volatile oil

表4 挥发油提取工艺优化正交试验设计与结果（n=9）Tab.4 Design and results of orthogonal test for the extraction process of volatile oil（n=9）

表5 挥发油提取工艺优化方差分析结果Tab.5 ANOVA results of the extraction process of volatile oil

1.木兰脂素 2.欧前胡素A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C.阴性对照品溶液图1 高效液相色谱图1.Magnolia 2.AmmidinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatogram

验证试验：取药材样品（鱼腥草40 g、薄荷20 g、广藿香20 g），置圆底烧瓶中，并安装冷凝管和挥发油测定器，持续加热，按最佳工艺回流提取，收集挥发油［8-9］，平行操作3 次，结果挥发油量分别为0.40，0.40，0.41 mL，平均0.403 mL，RSD为1.43%。

2.3 水提取工艺优化

正交试验：以加水量（因素A）、浸泡时间（因素B）、提取次数（因素C）和提取时间（因素D）为考察因素，以木兰脂素、欧前胡素和总固体含量为评价指标进行L9（34）正交试验［10-13］。结果见表6至表8。由表7和表8可见，因素C和因素D是主要影响因素，其中因素C对总固体含量有显著影响，因素D对欧前胡素含量有显著影响。综合各方面因素进行分析，最终确定水提取工艺为A2B2C3D1。

表6 水提取工艺优化因素水平Tab.6 Factors and levels of water extraction process

表7 水提取工艺正交试验设计与结果（n=9）Tab.7 Design and results of orthogonal test for the water extrac⁃tion process（n=9）

表8 水提取工艺优化方差分析结果Tab.8 ANOVA results of the water extraction process

验证试验：取除鱼腥草、薄荷、广藿香以外的药材样品，加入挥发油提取后剩余的药渣，收集煎煮液，滤过，浓缩至清膏，加入羟苯乙酯和苯甲酸钠适量，混匀，按最佳水提工艺，加水至规定量，即得水提样品，并进行含量检测，平行操作3次。结果见表9。

表9 水提取工艺优化验证试验结果Tab.9 Results of the validation test for the water extraction process

3 讨论

3.1 提取工艺路线设计

本研究中清利塞鼻洗液的制备是在考虑实验室设备条件、工业生产安全可行性等因素的基础上，设计合理的提取工艺路线。由于方中鱼腥草、广藿香和薄荷均含挥发油成分，故应综合考虑挥发油和提取油后药渣的水溶性成分，采用水蒸气蒸馏提取法。辛夷、白芷等药材的有效成分在水中溶解度高，故采用水提取法。

3.2 评价指标选择

中药方剂主要依靠其所含多种化学成分和活性分子发挥综合、协同的治疗作用。对提取工艺条件参数的选择，不仅要考虑主要药味所含指标成分的有效提取量，而且要兼顾其他药材的有效成分，仅单个定量指标不易将各味中药材的有效成分均充分表达，故本研究中的水提取工艺选择了木兰脂素、欧前胡素和总固体的含量作为评价指标。木兰脂素是辛夷的主要有效成分，欧前胡素是白芷的主要有效成分，两者均为方中主要的水溶性成分，与总固体含量结合评价，就能筛选出较合理的水提取工艺参数。

3.3 正交试验分析

采用正交试验优化中药类洗剂提取工艺时，多以有效成分、总固体的含量检测优选工艺参数，本试验中分别筛选出挥发油提取和水提取的最佳条件，经优选工艺提取的洗液质量得到了保证［14-15］。验证试验结果表明，水提液中木兰脂素含量波动较大，可能与药材质量及取样不均有关，日后将扩大样品量进行研究，以期得到更准确的数据。

3.4 薄层色谱分析

为了验证本课题所设计的提取工艺流程是否合理可行，对产品质量是否有提高作用，对采用新旧工艺所得样品进行薄层色谱对照。结果表明，采用新工艺所得样品，保留了更多挥发油成分，大幅提高了产品质量。