子痫前期患者与正常孕妇血清脂质组学成分对比分析

杨洋，马媛，栾丽霞，李懋

子痫前期（pre-eclampsia，PE）是最常见的产科严重并发症，发病率约为4%～6%，是产妇死亡的三大主要原因之一[1]。但PE 病因不明，任何一种单一学说均不能解释PE 的发病原因和机制[2]。脂质不仅用于能量储存以及生物膜组成，其在细胞分化、凋亡、迁移以及代谢中也发挥重要作用[3]。近年研究表明一些小的脂质分子在多个细胞信号通路中发挥作用[4]。PE 患者易发生脂质代谢异常，已有多种不同类型的脂质成分参与PE 的发生发展[5]。国外已有甘油磷脂[6]、鞘脂类[7]、甘油酯[2]以及脂肪酸[3]等在PE 中差异表达的报道，以上这些脂质成分也可能成为预测PE 发生的潜在预警分子。但是欧美地区肥胖人群比例升高，其中孕产妇超重或肥胖者已超过60%[8]，而脂质成分及水平受体质量影响较大，亚洲人种与欧美人种的体质量指数存在差异，目前尚缺乏国内PE孕妇血清脂质组学系统研究。因此，本研究对PE 孕妇血清中不同类型的脂质成分进行检测，了解孕妇血清中的差异表达情况，探索这些脂质成分成为孕妇PE 发生的预警分子的可能，为基础研究提供新的研究方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择西安医学院第一附属医院（我院）妇产科2019 年1 月1 日—7 月1 日收治的PE 患者16 例为PE组。选取同期自然分娩正常孕妇16 例为正常对照组（NC组）。纳入标准：①PE 组患者诊断符合PE，诊断标准参照第9版人民卫生出版社《妇产科学》；②自然妊娠；③单胎妊娠；④既往均无高血压或者子痫病史。排除标准：①有剖宫产史；②患有严重精神、心理疾病或智力障碍，不具备自主交流和自理能力；③拒绝签署临床试验伦理知情同意书。

1.2 仪器与设备Acquity UPLCTM system（Waters Corporation，美国）；Phenomenex Luna silica 3 μm（内径150 mm×2.0 mm）色谱柱（Waters Corporation，美国）；Phenomenex-Kine-tex 2.6 μm（内径100 mm×4.6 mm）色谱柱（Waters Corporation，美国），真空离心浓缩仪（Genevac Corporation，英国）；超滤离心管（Millipore，美国）；Milli Q 超纯水系统（Millipore，美国）；乙腈和甲醇色谱纯（HPLC，Merck Corporation，德国）；氯仿、甲醇、氨水、甲酸和醋酸铵（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 血样采集孕妇入院后清晨空腹采集静脉血8 mL，3 000 r/min 离心5 min 后，吸取上层血清，标记后置于-80 ℃冰箱保存待检测。本研究经我院伦理委员会同意并批准（批准号：XYYFY2020LSK-002），所有患者均签署了知情同意书。

1.4 脂质分析

1.4.1 脂质提取及检测本研究采用超高效液相色谱串联质谱（ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法对2 组患者血清中的脂质成分进行分析。首先采用Bligh 和Dyer 的改良方法提取脂质[9]。极性脂采用Phenomenex Luna silica 3 μm（内径150 mm×2.0 mm）色谱柱，流动相A 为水相，溶液使用氯仿、甲醇和氨水，比例为89.5∶10∶0.5；流动相B 为有机相：包含氯仿、甲醇、氨水和水，比例为55∶39∶0.5∶5.5。严格控制2 种试剂的流速，柱温控制在40 ℃，流速500 μL/min。中性脂采用Phenomenex-Kine-tex 2.6 μm（内径100 mm×4.6 mm）色谱柱。流动相溶液使用氯仿、甲醇和醋酸铵，流速150 μL/min，20 min 之内完成。后续在正负离子模式下使用质谱检测器进行脂质定性、定量及成分确认分析实验过程与既往研究[10]相同。

1.4.2 脂质成分类型本研究共分析甘油磷脂、鞘脂、甘油酯、甾醇类及脂肪酸5 大类脂质成分：①甘油磷脂包括磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines，PC）、磷脂酰乙醇 胺（phosphatidylethanolamines）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositols，PI）、磷脂酸（phosphatidic acids，PA）、磷脂酰丝氨 酸（phosphatidylserines，PS）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerols，PG）、溶血磷脂酰胆碱（lyso-PC，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lyso-PE，LPE）、溶血磷脂酰肌醇（lyso-PI，LPI）、溶血磷脂酸（lyso-PA，LPA）、溶血磷酯酰丝氨酸（lyso-PS，LPS）；②鞘脂包括鞘磷脂（sphingomyelins，SM）、鞘氨醇（sphingosine，Sph）、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）、神经酰胺（ceramides，Cer）、葡萄糖基神经酰胺（glucosylceramides，GluCer）、半乳糖基神经酰胺（galactosylceramides，GalCer）、乳糖基神经酰胺（lactosylceramides，LacCer）、神经酰胺三己糖苷（Ceramide trihexoside，Gb3）、单唾液酸二己糖基神经节苷脂（monosialodihexosyl gangliosides，GM3）；③甘油酯包括三酰甘油（triacylglycerol，TG）、二酰甘油（diacylglycerols，DAG）；④甾醇类包括胆固醇酯（Cholesteryl esters，CE）、胆固醇（Cholesterol，Cho）；⑤脂肪酸为游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0 统计学软件进行分析。定量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用两独立样本均数的t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者的一般情况比较 2 组患者年龄和采血时体质量指数（BMI）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。PE 组患者妊娠时间低于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 2 组患者一般情况比较 （）

表1 2 组患者一般情况比较 （）

2.2 2组患者血清甘油磷脂成分分析 本研究结果显示，2 组患者血清中甘油磷脂成分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 2 组患者血清甘油磷脂成分比较 （mmol/mL）

2.3 2组患者血清鞘脂成分分析 本研究结果显示，2 组患者血清中鞘脂成分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 2 组患者血清鞘脂成分比较 （mmol/mL）

2.4 2组患者甘油酯、脂肪酸及甾醇类成分分析 本研究结果显示，2 组患者血清中甘油酯和甾醇类成分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。PE 组患者血清中FFA 含量高于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 2 组患者血清甘油酯、脂肪酸及甾醇类成分比较 （mmol/mL）

2.5 2组患者不同类型FFA 差异分析 进一步对不同类型FFA 进行分析，发现PE 组孕妇血清中FFA22:4、FFA20:5、FFA20:4、FFA20:3、FFA18:2、FFA18:1、FFA16:1、FFA16:0 和FFA14:0 较NC 组升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 2 组患者血清不同类型脂肪酸比较 （mmol/mL）

3 讨论

脂质代谢是三大基础代谢之一，是主要的供能来源。高表达水平的脂质和脂肪酸可引起氧化应激和炎症反应，造成血管内皮损伤[5]。妊娠前及妊娠期的脂代谢和脂肪酸代谢异常在PE 的发生发展中发挥重要作用[2]。故本研究对PE 孕妇血清中的脂质成分进行检测及分析。

甘油磷脂是机体含量最多的一类磷脂，是细胞膜双层膜结构的重要组成成分之一。甘油磷脂由于取代基团不同又可以分为许多类，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇等。鞘脂具有1 个极性头基和2 个非极性尾，属极性脂类，是仅次于磷脂的第2 大类膜脂。本研究发现，2 组孕妇的甘油磷脂和鞘脂类成分差异无统计学意义（P＞0.05）。既往研究显示，PE 孕妇血清中[11]及胎盘中[12]，甘油磷脂的含量显著增加。也有研究发现，PE 孕妇在孕12～14 周就已经出现了血清中甘油磷脂的表达异常[6]。上述研究结果与本研究存在差异可能与其纳入人群BMI 过高，检测组织及孕周不同有关，还需进一步研究。另有研究发现，妊娠中期母体血清中不同类型的鞘脂类和溶血磷脂类可预测妊娠晚期PE 的发生[7]。鞘脂类可导致胎盘氧化应激及炎症反应异常[13]是PE 发生的可能机制之一。但本研究尚未涉及不同类型鞘脂类的分析，这也将在后续研究开展。

脂肪酸是许多更复杂的脂的组成成分。甘油酯指由甘油和脂肪酸经酯化所生成的酯类。甾醇类指类固醇化合物。既往研究提示脂肪酸、甘油酯和甾醇类脂质与PE 的患病风险有关[2]，PE 患者血清以及胎盘组织中TG 含量增高[5]。另有研究表明PE 患者血清中脂肪酸水平也高于正常孕妇[14]。本研究发现，FFA 水平在PE 患者血清中较正常孕妇显著升高，与既往研究相符。过多的FFA 对胎盘具有脂肪毒性，FFA 异常表达可通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）和caspase-7 介导滋养细胞凋亡[3]。PE 患者血清中FFA 升高，FFA 被内皮细胞吸收并酯化，形成TG 在内皮细胞累积，导致前列腺素和一氧化氮释放减少，引起内皮细胞功能障碍[5]。同时，血管内脂质沉积可导致子宫螺旋动脉粥样硬化[15]，进一步加重了PE 时螺旋动脉重铸障碍后的病理性改变。

既往研究中少有报道PE 孕妇血清中不同类型FFA 的表达。不同类型的FFA 不仅与炎症、细胞凋亡有关，也参与线粒体脂肪酸的氧化，是妊娠期母体及胎盘功能的重要代谢途径[2]。本研究进一步对2 组孕妇血清中不同类型FFA 的水平进行检测，发现PE组孕妇血清中FFA22:4、FFA20:5、FFA20:4、FFA20:3、FFA18:2、FFA18:1、FFA16:1、FFA16:0 和FFA14:0高于NC 组（P＜0.05）。但这些不同类型FFA 在PE发病机制中的作用仍需进一步研究。

综上，本研究分析了PE 孕妇血清中脂质成分，结果显示多种不同类型FFA 存在差异表达；从代谢组学的角度，初步阐述了PE 的部分发病机制，并为不同类型FFA 可能为PE 预测分子提供了一定理论基础。