成纤维细胞的自噬性溶解死亡在增生性瘢痕消退过程中的作用

张 剑，宋 菲，王西樵

上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤科，上海 200025

增生性瘢痕的发生机制尚未明晰，一直是临床难以解决的问题，缺乏有效的治疗手段。然而值得注意的是，增生性瘢痕临床上虽未经治疗，但多年后可能自行消退，变平变软。细胞凋亡被认为是增生性瘢痕消退成熟最主要的方式［1］。研究表明，瘢痕中存在严重的缺血缺氧环境［2］，而缺血缺氧是细胞产生自噬的重要因素［3］。自噬是细胞在缺氧和缺营养条件下，通过吞噬自身细胞器，消化后获取能量，维持细胞代谢活动的一种生存方式。生理状态的自噬促进细胞的存活，长时间自噬或过度自噬可能导致细胞死亡，称为自噬性死亡。目前大多数研究认为自噬是细胞凋亡的上游启动因素，高水平的自噬导致细胞凋亡［4-5］。在瘢痕组织的消退过程中，自噬是否是细胞凋亡的启动因素尚未见文献报道。此外，相关研究［6-8］还发现另外一种自噬性死亡的方式，它没有发生细胞凋亡但具有独特的形态特征，称为自噬性溶解死亡。因此，本研究重点探索瘢痕消退过程中是否发生了自噬性溶解死亡，以期对未来瘢痕的治疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象、试剂与仪器

1.1.1 研究对象 收集上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤科2018 年6 月—2019 年6 月烧伤患者16例的瘢痕组织。纳入标准［9］：①增生性瘢痕发生时间为3～6 个月，表现为深红色、厚度增加、瘙痒和疼痛。②消退期瘢痕发生时间为2 年左右，瘢痕厚度变薄，瘙痒和疼痛减轻。排除标准：①瘢痕感染。②瘢痕溃疡。③瘢痕疙瘩。④糖尿病。⑤高血压。根据患者增生性瘢痕发生时间分为增生期瘢痕（对照组）和消退期瘢痕（试验组）2 组，每组8 例。试验获上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准（批号为2021临伦审第15号）。所有患者知情同意并签署同意书。

1.1.2 试剂与仪器 DMEM 培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FCS）均购自美国GIBCO 公司。0.1% Triton X-100、1%牛血清白蛋白、兔抗小鼠二抗、 小鼠抗兔二抗、 3- 甲基腺嘌呤 （3-methlyadenine，3-MA）均购自北京索莱宝公司。微管相关蛋白轻链-3（microtuble-associated protein light chain 3，LC3）、低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）、beclin-1、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、 caspase-9， BCA 蛋白检测试剂盒（BCA Protein Assay Kit） 均购自美国Abcam 公司。4'，6'- 二脒基-2- 苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverin，MDC）检测试剂盒、Calcein/PI荧光染料试剂盒均购自美国Sigma公司。

透射电子显微镜（HT7700，日本日立公司），荧光显微镜（CFM-500，德国蔡司公司），缺氧培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪（FC-500，美国贝克曼公司）。

1.2 方法

1.2.1 透射电镜观察瘢痕组织的超微结构变化 瘢痕组织标本用2.5%戊二醛和1%硫酸先后各固定2 h。然后将样品以30%、50%、70%、80%、90%，100%乙醇梯度脱水，各10 min，然后浸泡、包埋在环氧树脂中，切片成60 nm 的超薄切片。切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅溶液染色。在75 kV 常规电压下，用透射电镜观察瘢痕组织内成纤维细胞的自噬情况。

1.2.2 瘢痕组织成纤维细胞分离培养 将取下的2组患者的瘢痕组织立即放入DMEM 培养基中，送到实验室进行快速处理，碘伏消毒5 min，PBS 冲洗3 次，各5 min。用手术刀去除瘢痕表皮和剩余的脂肪组织，切成1 mm2的组织片。将组织片放入装有DMEM 和10%FCS 的培养瓶中，并在37 ℃下于5%CO2培养箱中孵育。1 周后，将孵育出的成纤维细胞迁移出组织片。2 周后，成纤维细胞汇合并进行2～6 次传代，供后续试验使用。

1.2.3 建立细胞缺氧缺血模型 将汇合率为80%的成纤维细胞置于缺营养和缺氧条件中，参照以往文献（正常培养条件为10%FCS+21%O2），将培养条件设置为0.5% FCS+0.5% O2，模拟消退期瘢痕内的缺血缺氧环境［7］，分别于0、12、24、48 h 收集成纤维细胞。分别做作电镜观察、免疫荧光、活细胞/死细胞检测等。

另外，同上述成纤维细胞的缺营养和缺氧培养条件，试验组在24 h 和/或48 h 时相点加入终浓度为30 μg/mL 的3-MA，对照组加入等量PBS，分别于0、12、24、48 h收集细胞，流式细胞仪检测细胞自噬性溶解死亡和凋亡，Western blotting 检测HIF-1、beclin-1、LC3和caspase-3、caspase-9的表达。

1.2.4 细胞死亡的测定 研究用Calcein/PI 荧光染料试剂盒检测活/死细胞，观察缺氧和缺营养对成纤维细胞死亡的影响。具体步骤为：收集细胞，去上清液，用PBS 清洗细胞3 次；再用PBS 制备细胞悬液（1×105细胞/mL）；取100 μL 染色液加入200 μL 细胞悬液内，混匀；37 ℃温箱孵育15 min。荧光显微镜观察和拍照，绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死亡细胞。

1.2.5 免疫荧光检测 LC3 是公认的自噬标志物，在自噬通路中发挥核心作用，并促进自噬小体的形成。试验用LC3 和Annexin V 来标记细胞自噬和细胞凋亡。收集成纤维细胞，4%甲醛中固定，PBS洗涤，并在室温下用0.1% Triton X-100 渗透15 min。用1%牛血清白蛋白（1% BSA）阻断后，用抗LC3 抗体（工作浓度1∶200）室温孵育1 h。LC3标记的兔抗小鼠二抗（工作浓度1∶100）在室温下取样1 h，然后用DAPI 染色。根据说明书，使用TUNEL 检测试剂盒进行细胞凋亡检测。

选取手术室急诊患者110例作为研究对象，根据护理方法将其分成两组。其中，对照组男28例，女25例，年龄34～72岁，平均年龄（53.85±4.72）岁；观察组男29例，女28例，年龄31～74岁，平均年龄（54.28±4.51）岁。两组患者的一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2.6 流式细胞仪检测 自噬的特征是自噬小体的形成，自噬小体包含一种酸性囊泡细胞器（acidic vesicle organelle，AVO），MDC可用于检测AVO的形成，作为检查自噬的发生。因此，为了区分凋亡和自噬性溶解死亡，我们使用MDC 荧光和PI 染色标记自噬性死亡细胞，使用Annexin-V 和PI染色标记凋亡细胞，最后通过计算，自噬性死亡细胞减去细胞凋亡细胞得出自噬性溶解死亡数量。按照说明书，收集和孵育细胞后，用蓝色（λ=488 nm）激发光照射细胞，产生红色荧光（λ=650 nm，胞浆）和绿色荧光（λ=510～530 nm，细胞核），用流式细胞仪检测凋亡和自噬性死亡细胞的数量。

1.2.7 Western blotting 分析 凋亡一般以caspase 的激活为特征，caspase-3 和caspase-9 表达升高是细胞凋亡的标志。因此，为了研究缺氧和缺营养过程中自噬和凋亡相关基因的变化，我们采用Western blotting检测HIF-1、beclin-1、LC3、caspase-3 和caspase-9 的表达。按照以上培养条件，将细胞接种在75 cm2培养瓶培养。0、12、24、48 h收集细胞，进行蛋白质抽提。采用BCA 蛋白检测试剂盒进行蛋白定量。SDSPAGE 胶分离蛋白质，转至硝酸纤维膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4℃孵育过夜；LC3 工作浓度1∶1 000， beclin-1 工作浓度1∶1 000， caspase-3、caspase-9 工作浓度1∶3 000，GAPDH 工作浓度1∶1 000；TBST 洗膜。二抗室温孵育l h，TBST 漂洗。然后化学显影，图形软件进行灰度分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 23.0 软件对研究数据进行统计分析，定量资料以±s表示。符合正态分布组间定量资料采用Student'st检验（单尾）。P＜0.05为差异有统计学意义。符合正态分布的多组间定量资料的分析使用One-way ANOVA 检验。当P≥0.05 时，认为方差齐性，用LSD 方法进行多重比较。方差不齐时，用Dunnett'st检验，进一步做多重比较。

2 结果

2.1 透射电镜观察瘢痕组织结果

透射电镜（图1）观察发现：在增生期瘢痕（对照组）内成纤维细胞肥大，内含大量细胞器，可见少量自噬小体，其中部分细胞器被吞噬。在消退期瘢痕（试验组）内，成纤维细胞显著缩小，自噬小体显著增加，大部分细胞质空泡化。随后，细胞质逐渐消失，细胞膜破裂，分解为珠状小泡或散在碎片，具有典型的自噬性细胞溶解死亡形态。

图1 增生期和消退期瘢痕组织自噬的透射电镜观察Fig 1 Transmission electron microscope observation of autophagy in proliferative and regressive scar

2.2 成纤维细胞透射电镜观察

在0 h 时相点，成纤维细胞的细胞质中有少量的细胞自噬小体。12 h 后，自噬小体和空泡明显增多，不仅吞噬细胞器，还吞噬细胞质中的胶原。24 h 后，部分细胞质内容物降解，细胞核收缩。48 h后，大部分细胞质内容物消失，细胞质呈空泡化。细胞核凹陷，染色质降解。随后，可见细胞膜破裂，一些残留的细胞质内容物流出（图2）。提示成纤维细胞在缺氧和缺营养条件下发生自噬性溶解死亡。

图2 不同时间点成纤维细胞的自噬观察Fig 2 Investigation of autophagy in fibroblasts at different time points

2.3 细胞死亡的测定结果

图3 成纤维细胞在缺氧和缺营养条件下的细胞死亡情况Fig 3 Cell death of fibroblasts under hypoxia and nutritional deficiency

2.4 免疫荧光结果

图4 中，红色为LC3 表达，代表自噬；绿色为Annexin V表达，代表细胞凋亡。结果显示：0 h时点有少量细胞自噬和少量细胞凋亡（0.14%±0.02%）。在12 h，细胞自噬和凋亡均有增加（0.20%±0.02%）。在24 h，大多数细胞发生自噬，细胞凋亡也达到高峰（0.45%±0.52%，P=0.031）。在48 h，自噬也有高表达，但细胞凋亡率减少（0.33%±0.03%）。结果表明细胞凋亡发生时均有自噬的发生，然而48 h的结果与Calcein/PI 荧光染料试剂盒检测的死亡细胞不一致，说明在48 h时相点，除了细胞凋亡外，可能还有自噬性溶解死亡。

图4 成纤维细胞缺氧和缺营养条件下自噬和凋亡共染色结果Fig 4 Co-staining of autophagy and apoptosis in fibroblasts under hypoxia and nutritional deficiency

2.5 流式细胞仪检测结果

研究分别标记细胞凋亡和自噬诱导的死亡（简称自噬性死亡），采用流式细胞仪检测2 组细胞的数量。结果发现：在0 时相点，细胞凋亡率为0.12%±0.01%，12 h 有所增加，24 h 时显著升高（0.42%±0.04%，P=0.038），48 h 时略有下降（0.34%±0.03%，P=0.031）；然而，在24 h 和48 h 组加入3-MA 后，细胞凋亡数量明显降低，表明细胞凋亡是由自噬引起的。

此外，我们利用MDC 和PI 标记检测自噬性死亡。结果见图5，在治疗前（0 h），有少量细胞死亡发生（2.00%±0.21%），12 h有增加。24 h细胞死亡明显增加（5.15%±0.47%，P=0.030），48 h 达到高峰（5.98%±0.61%，P=0.020）。而在培养24 h 和48 h 时加入3-MA 后，细胞死亡显著降低，分别为3.20%±0.31%和4.05%±0.43%（P=0.039 和P=0.041）。研究结果表明，随着缺氧和缺营养时间的延长，自噬性死亡逐渐增加，并可通过抑制自噬而降低。

图5 流式细胞仪检测成纤维细胞自噬性死亡和细胞凋亡Fig 5 Assay of cell autosis and apoptosis by flow cytometry

试验中，大部分细胞都可以观察到自噬。自噬是细胞死亡的启动因子，包括细胞凋亡和自噬性溶解死亡2 种形式。自噬引起的死亡代表总细胞死亡，因此，自噬性溶解死亡数量=自噬引起细胞死亡的总数量-细胞凋亡数量，因此计算得出自噬性溶解死亡的细胞数量为：0 时相点为1.90%±0.25%，12 h 有所增加，24 h 显著增加（4.73%±0.51%，P=0.038），在48 h 达到高峰（5.64%±0.61%，P=0.021）。加入3-MA 后，细胞死亡数量显著降低，24 h 和48 h 分别为3.10%±0.35% （P=0.042） 和 4.05%±0.43% （P=0.036）。由此可见自噬性溶解是细胞死亡的主要形式，细胞凋亡是次要的死亡形式。

2.6 Western blotting检测结果

Western blotting检测结果见图6。HIF-1在0 h有一定表达，12 h表达增加，24 h达到峰值。同时beclin-1、LC3和caspase-3、caspase-9表达增加。3-MA抑制后，除beclin-1 外，HIF-1、LC3、caspase-3 和caspase-9 的表达均降低。这是由于3-MA抑制作用于beclin-1的下游，抑制自噬体形成，因此对其表达没有影响。结果表明，抑制自噬，能够减少细胞凋亡基因的表达，也说明凋亡是由自噬引起。48 h时，除LC3仍保持高表达外，其余蛋白均显著下降。这些结果表明，缺氧缺营养延长时（比如48 h），凋亡蛋白表达减少，而LC3维持在高水平，导致自噬性溶解死亡。

图6 Western blotting检测细胞自噬和凋亡Fig 6 Assay of apoptosis-and autophagy-related proteins by Western blotting

3 讨论

细胞在饥饿、ATP 不足、生长因子缺乏条件下，就可以启动自噬的发生。自噬是一种在营养缺乏时，消化细胞质细胞器，以实现能量循环的细胞代偿过程。生理水平的自噬可促进细胞存活，促进成纤维细胞增殖和瘢痕增生［10］。而过度的自噬可导致成纤维细胞自噬性死亡，促进瘢痕消退成熟。

研究在瘢痕组织和体外实验均发现细胞自噬性溶解死亡。在早期，自噬体形成过多，自噬体不仅吞噬细胞器，还吞噬胶原纤维，然后大部分的细胞质内容物逐渐消失，细胞质空泡化。细胞核凹陷，染色质降解。在自噬后期，细胞破裂为囊泡样颗粒。此前在对瘢痕的研究中未见报道。

此外，体外培养成纤维细胞24 h时，一方面透射电镜下观察到大量自噬小体形成，同时免疫荧光观察到细胞凋亡和自噬也达到高峰。另一方面，蛋白表达层面发现beclin-1 和LC3 的表达也明显增加，凋亡相关蛋白caspase-3 和caspase-9 的表达也明显增加。但加入3-MA 后，细胞凋亡和自噬性溶解死亡降低，说明2 种细胞死亡形式都是由自噬引起的，阻断自噬可降低细胞死亡。此外，严重缺氧和缺营养培养48 h后，caspase-3 和caspase-9 也下降，伴随低水平的细胞凋亡，但LC3保持高水平，并伴有高水平的自噬性溶解死亡。与细胞凋亡呈相反趋势，说明延长缺氧和缺营养时间，产生以自噬性溶解为主的细胞死亡，LC3可能发挥主要作用。

需要指出的是，前期研究表明，线粒体自噬的过程依赖于HIF-1的表达，阻断HIF-1可以抑制自噬，抑制细胞存活，增加细胞凋亡［11-12］。本研究结果显示，在缺氧和缺营养早期（6～24 h），其在促进细胞自噬和凋亡方面起主导作用。但在晚期（48 h），HIF-1降低，但自噬仍然保持在较高水平，说明此时HIF-1 不是导致自噬的决定因素，而过度缺氧和缺营养可能就是发生自噬溶解的独立死亡因素，细胞从“自我代偿”进入“自我死亡”。因此在缺氧和缺营养状态下，自噬性溶解死亡和凋亡可能共同参与了细胞的死亡。

总之，缺氧是增生性瘢痕的微环境特征，自噬贯穿了瘢痕演变的整个过程。在严重缺氧和缺营养条件下，除了细胞凋亡以外，自噬性溶解死亡可能是引起瘢痕消退成熟的主要方式，有别于以往瘢痕成熟的“细胞凋亡论”。因此，在未来瘢痕治疗过程中，诱导瘢痕中过度自噬和自噬性溶解死亡，可能促进和加快瘢痕的消退和成熟。