养心汤对同型半胱氨酸致大鼠血管内皮功能障碍的影响*

皇甫海全 毕尚青 于海睿

（广州中医药大学附属宝安中医院，广东 深圳 518133）

血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化（AS）形成的始动因素，是多种血管疾病的病理基础［1］。生理状态下血管内皮能够维持血管壁完整性与通透性，调节血管张力及凝血纤溶系统平衡，参与细胞黏附增殖、代谢、自噬、凋亡等过程。而氧化应激损伤［2］、炎症反应损伤［3］、高血压［4］、高血糖［5］、高血脂［6］、缺血/再灌注损伤［7］、高剪切力等因素均可导致血管内皮功能障碍甚至内皮损伤，激活炎症反应，加速血管壁脂质沉积并向内膜下迁移，最终形成AS。因此，改善血管内皮功能，减轻内皮损伤，一定程度上可延缓AS的进程。前期基础研究证实，中药养心汤可降低不稳定型心绞痛模型家兔颈总动脉内中膜厚度、搏动指数及阻力指数［8］；上调心肌缺血家兔模型血清一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）水平［9］；降低p53基因转染易损斑块家兔模型血浆巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、白细胞介素-18（IL-18）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的水平［10］，发挥抗动脉粥样硬化的作用。基于前期研究基础及血管内皮功能障碍动脉粥样硬化学说，本研究拟建立血管内皮功能障碍模型，应用养心汤进行干预，观察其对血管内皮功能障碍的影响，并对相关机制进行探讨，旨在进一步明确养心汤抗动脉粥样硬化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄雄性SD大鼠，40只，体质量180～220 g，购于实验动物中心（合格证号：SCXK-2013-004），饲养条件：温度18～22℃，湿度45%～55%、风速0.1～0.2 m/s，24 h自由摄水，12 h明暗循环照明。

1.2 试药与仪器 养心汤药物组成包括炙黄芪、党参、茯神、茯苓、五味子、清半夏、川芎、远志、炒酸枣仁、柏子仁、肉桂、当归、炙甘草13味中药。取养心汤生药共485 g，加水煎煮2次，每次1.5 h，合并滤出液，将滤出液浓缩成相对浓度1.20（90℃）的浸膏270 g，冷却至室温，加入等量乙醇摇匀，静置12 h，取上层清液，回收乙醇并浓缩成相对浓度1.25（80℃）的浸膏90 g，每克养心汤浸膏含有生药5.39 g，由本院制剂室制备。叶酸片（天津力生制药股份有限公司生产，国药准字H12020215）。NO、内皮素-1（ET-1）、同型半胱氨酸（Hcy）、蛋白C受体（sEPCR）、可溶性血栓调节蛋白（sTM）试剂盒（上海信裕生物），3%戊二醛（北京索莱宝），Hcy（西安康诺化工），莱卡超薄切片机（德国LeicaEM UC7），透射电子显微镜（日立HT7800），超低温冰箱（赛默飞902-ULTS），离心机（德国5415D）。

1.3 造模与分组 采用高蛋氨酸饲料喂养大鼠建立Hcy血管内皮功能障碍模型［11］。40只大鼠随机分为空白组、模型对照组、叶酸组、养心汤组，每组10只。空白组喂养常规普通饲料，其余3组喂养含3%L-蛋氨酸的饲料，共喂养12周建立血管内皮功能障碍模型。根据预实验结果，喂养12周后大鼠胸主动HE染色可见血管内皮不完整连续，血管内皮部分脱落，细胞缺失处内膜不光滑，有少许红细胞、白细胞黏附（见图1），表明内皮功能障碍大鼠模型建立成功。

图1 大鼠胸主动脉血管内皮损伤（HE染色）

1.4 干预方法 于实验第13周进行药物干预，空白组、模型组灌胃等体积纯净水；叶酸组灌胃叶酸混悬液1.8 mg/（kg·d）；养心汤组灌胃养心汤浸膏混悬液2.34 g/（kg·d），灌胃4周。

1.5 标本采集与检测 给药结束后，大鼠麻醉称重，腹主动脉采血，4℃，3 000 r/min，离心10 min，分离血清冻存待测；取血后，迅速剪开胸腔，沿大鼠脊柱小心分离整段主动脉，眼科手术剪刀去掉血管多余组织，取5 mm胸主动脉用3%戊二醛溶液固定，透射电镜观察胸主动脉血管内皮超微结构。ELISA法检测血清NO、ET-1、Hcy、sEPCR、sTM水平，严格按照试剂盒说明书步骤进行。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态 模型建立期间40只大鼠未出现死亡，空白组大鼠一般状况良好，毛色光滑、柔顺，活动量正常，进食良好。其余3组大鼠表现为毛色暗黄，进食量、活动量减少。灌胃给药期间养心汤组大鼠死亡1只，解剖后发现，为食物误吸进入气管导致死亡，大鼠总体死亡率为2.5%。灌胃后，养心汤组、叶酸组大鼠一般情况好转，与模型组比较，毛发色泽改善，进食量、活动量增加，对外界刺激反应较灵敏。

2.2 各组大鼠血管内皮电镜结果 见图2～图9。空白组可见血管内皮连续完整，表面光滑，内皮细胞呈梭形，单层紧密排列，染色质均匀，可见结构正常细胞器、内质网和线粒体，丰富的核糖体，内皮细胞下可见含有胶原纤维和弹力纤维的结缔组织。模型组可见血管内皮大部分脱落，偶见残存的内皮，内皮细胞肿胀向血管腔突起，细胞核不规则，细胞膜呈虫蚀样变，部分核孔扩张，异染色质大多聚集于核膜下，胞质内空泡明显增多，粒体肿胀变性，部分平滑肌细胞向内皮下层迁移。叶酸组可见血管内皮部分肿胀，可见完整的内皮，内皮细胞肿胀，细胞质透亮，连接松散，线粒体肿胀，脊溶解、断裂、消失，胶原纤维增多，平滑肌细胞层不连续。养心汤组可见血管内皮基本连续完好，内膜表面光滑，未见明显突起，内皮细胞轻度变性，呈梭形，可见细胞核，内皮细胞下层的胶原纤维和弹力纤维结构基本完整。

图2 空白组（7 000倍）

图3 空白组（15 000倍）

图4 模型组（7 000倍）

图5 模型组（15 000倍）

图6 叶酸组（7 000倍）

图7 叶酸组（15 000倍）

图8 养心组（7 000倍）

图9 养心组（15 000倍）

2.3 各组大鼠血清NO、ET-1、Hcy、sEPCR、sTM水平比较 见表1。与空白组比较，模型对照组大鼠血清NO水平降低，ET-1、Hcy、sEPCR、sTM水平升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，叶酸组、养心汤组大鼠血清NO水平升高，ET-1、Hcy、sEPCR、sTM水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组大鼠血清NO、ET-1、Hcy、EPCR、TM水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清NO、ET-1、Hcy、EPCR、TM水平比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别空白组模型组叶酸组养心汤组n 10 10 10 9 NO（μmol/L）14.66±1.15 8.70±0.82*13.12±0.49△13.04±0.65△ET-1（pg/mL）117.46±17.40 230.87±24.78*143.66±24.73△141.90±23.92△Hcy（μmol/L）1.73±0.19 4.09±0.23*2.14±0.18△2.18±0.22△sEPCR（pg/mL）214.09±16.41 430.96±22.74*342.10±18.86△329.01±23.42△sTM（pg/mL）57.91±11.15 107.82±13.33*72.60±10.95△69.21±12.48△

3 讨论

有研究认为Hcy水平与冠脉狭窄程度的相关性仅次于高血脂、高血压、吸烟等危险因素［12］。Hcy可以通过氧化应激反应、内质网应激、促进死亡受体表达等多种机制损伤血管内皮，破坏内皮的屏障作用，减少舒血管物质的释放，增加缩血管物质的生成，导致血管张力增加顺应性下降、血小板黏附、脂质沉积、炎症反应，最终形成动脉粥样硬化。大量的临床试验证实口服叶酸能降低Hcy浓度，改善血管内皮功能，抑制脂质过氧化，减少血管平滑肌增殖迁移，延缓动脉粥样硬化的发生［13］。ET是目前已知的缩血管效应最强的活性多肽，ET-1主要由血管内皮细胞表达，具有促进血管平滑肌、心肌收缩及促进神经内分泌的功能，在维持心血管系统平衡稳定方面具有重要作用。NO是目前发现的舒张血管作用最强的物质［14］，具有抑制血管收缩及细胞增殖，并参与ET的清除作用，还具有减少血小板聚集和炎症细胞黏附等功能［15］。血栓调节蛋白（TM）是内皮细胞膜表面的一种糖蛋白，具有维持凝血与纤溶之间平衡的作用［16］。通常情况下，TM与凝血酶结合形成凝血酶-TM复合物，并在Ca2+作用下激活蛋白C，进一步形成凝血酶-TM-蛋白C复合物（APC）。在蛋白S的作用下APC灭活因子Ⅴ、Ⅷ并抑制纤溶酶原激活抑制物，从而抑制纤维蛋白原的形成及血小板的聚集，预防血栓的形成［17］。当血管内皮受损或功能紊乱时，TM大量产生并释放至循环血液中，进入循环中的TM能够减轻血管炎症和免疫过程中产生的细胞因子，发挥保护内皮细胞功能的作用，因此其血浆浓度升高可敏感反映各种原因的血管内皮细胞的损伤。内皮细胞蛋白C受体（EPCR）属于一个多功能糖蛋白，选择性地表达于大血管内皮细胞上，是近年发现的具有抗炎和抗凝作用的蛋白。当各种因素导致内皮细胞受损，血浆中EPCR浓度明显升高，成为反映内皮细胞损伤的敏感指标，EPCR可作为血管内皮损伤的分子标记物。可溶性血管内皮细胞sEPCR和sTM主要由血管内皮细胞分泌的一种糖蛋白，是蛋白C系统的主要组成部分，其通过参与蛋白激酶C等介导的信号系统调节凝血、纤溶及炎症反应，维持血管内环境稳定［18］。因此sEPCR、sTM作为血管内皮损伤敏感而特异的分子标志物反映血管内皮细胞功能。本研究表明养心汤可增加大鼠血清的NO水平，减少ET-1、Hcy、sEPCR、sTM释放，同时电镜结果更加直观地表明养心汤能够减轻大鼠血管内皮损伤程度，改善血管内皮功能障碍，这可能是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一。

养心汤出自《证治准绳·类方·惊》，主治心虚血少、惊惕不宁，由黄芪、党参、当归、川芎等13味中药组成，具有益气养血、宁心安神功效，方中重用黄芪为君药，性甘微温，归肺脾两经，以补益心气，使气行血脉通畅，与党参合用共奏大补元气之功；臣药半夏、茯苓、茯神、远志健脾安神；柏子仁、酸枣仁、五味子养心神而敛心气；佐药为川芎、当归行气活血化瘀，使药为炙甘草，益气复脉，调和诸药，与肉桂合用鼓舞心阳，全方共奏益气活血、养心安神之功。现代药理研究认为黄芪通过上调eNOS表达，促进NO生成，促进血管内皮细胞增殖及整合素活性，抑制泡沫细胞形成及血管平滑肌细胞增殖［19］；当归提取物阿魏酸可上调PGI2表达，下调TXA2表达，抗血小板聚集，改善高脂诱导的血管内皮细胞损伤［20］。川芎乙醇提取物可上调内皮细胞中eNOS mRNA表达，调控eNOS活性促进NO生成，发挥对内皮细胞的保护作用［21］。Hcy诱导血管内皮功能障碍大鼠的研究证实，养心汤可上调NO表达，抑制ET-1、Hcy、sEPCR、sTM表达，改善血管内皮功能障碍，进一步阐释了养心汤发挥抗动脉粥样硬化的作用机制与保护血管内皮、调节内皮相关分子、维持内环境稳定相关。