高通量测序技术在食品微生物检测中的应用

杨光萍

（贵州省检测技术研究应用中心，贵州贵阳 550014）

近年来，食品种类的多元化发展离不开食品工业技术的不断提升，而食品安全问题也逐渐被广大消费者密切关注。根据各级市场监督管理部门所公布的食品抽检情况，食品微生物超标问题尤为凸显。其中，致病性微生物对人体感染所造成的危害是难以预估的，因此采用更为高效、合理的食品安全检测技术变得至关重要。目前，食品微生物检测主要根据GB 4789系列国家标准中规定的传统培养、分离及鉴定方法，但存在实验耗时长、步骤烦琐等问题，特别是对于处理食品安全突发事件来说存在困难。随着分子生物学实验技术的不断发展，高通量测序技术（High-Throughput Sequencing）在微生物群落结构、种类鉴定、功能分析等多个方面已有较多研究[1]。本文基于高通量测序技术的优势，总结并分析其在食品微生物检测中的应用和发展，以期为食品微生物检测技术的提升提供更多解决方案，促进检测技术的优化和升级。

1 高通量测序技术

Sanger等在20世纪70年代中期发明了DNA末端终止法测序技术，为生物遗传密码的解析提供了技术上的可能。1986年，第一台基因分析仪的面世标志着第一代测序技术时代的到来，自此，生物学研究进入了新的开端。但第一代测序平台实验耗时长、成本高、通量低，直到2005年第二代测序仪问世，使得大规模的基因组测序成为了可能[2]。目前，第三代测序仪平台也已经开始得到应用，但占据了高通量测序技术市场的还是第二代测序平台。

高通量测序技术又称为下一代测序技术（Next-Generation Sequencing Technology，NGS）或是深度测序（Deep Sequencing），其技术优势是能够一次性对上百万条DNA分子并行测序，并且检测结果更加准确、实验成本更低，在生物学相关领域得到广泛认可和应用[3]。第二代高通量测序技术主要包括454焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）、SOLiD测序技术（Supported Oligo Ligation Detetion）、连接酶测序技术和Solexa测序技术[4-5]，无论何种第二代测序平台，其技术核心原理均为边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。

2 高通量测序技术在食品安全检测中的运用

目前，高通量测序技术对食品微生物进行检测的研究中多为利用16S rDNA/rRNA测序。16S rDNA是编码核糖体16S rRNA亚基的基因序列，在微生物菌属的基因结构、功能上高度保守，同时具有长度适中、拷贝量大、易扩增等优点，因此常用于微生物的分子生物学研究中[6]。此外，运用较多还有宏基因组/转录组测序方法。

2.1 发酵食品微生物检测

发酵食品是最具我国民族特色的食品之一，已有上百年的生产和食用历史，制作工艺成熟、食品种类丰富，最具代表性的便是腐乳和白酒。发酵技术充分利用了微生物对食品原材料中各种营养物质的分解作用，从而形成了发酵食品独特的风味，因而研究微生物种群结构和功能是提升发酵食品风味的必经之路。

细菌16S rRNA具有高度特异性及保守性，而真菌ITS序列具有广泛的序列多态性，此两种序列在微生物种属研究中扮演着至关重要的角色[7-8]。石黎琳等[9]合成引物515F、907R、ITS1F及ITS2R，通过Illumina PE250测序，发现腐乳自然发酵过程中微生物菌落结构多变化，在第一阶段优势种群为乳球菌属（Lactococcus）、久浩酵母属（Guehomyces）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和假丝酵母属（Candida）；第二阶段优势种群为久浩酵母属、假丝酵母属、假单胞菌属、类香味菌属（Myroides）和丛毛单胞菌属（Comamonas）；发酵第三阶段优势种群为链格孢属（Alternaria）、赤霉菌属（Gibberella）、果胶杆菌属（Pectobacterium）和乳球菌属。不同地方或是不同发酵工艺的腐乳，其微生物种群结构也会有较大的差异。万红芳等[10]通过扩增细菌16S rRNA及真菌18S rRNA利用Illumina Miseq测序平台研究发现，2种夹江腐乳中细菌种群结构相似，且优势细菌种群为芽孢杆菌属（Bacillus），但真菌种群结构具有较大差异，香辣腐乳种优势真菌为曲霉属（Aspergillus）、白菜腐乳优势真菌为毕赤酵母属（Pichia）；同样利用细菌16S rRNA和真菌ITS序列进行扩增测序，结果表明，茨河腐乳中优势真菌为毛霉（Mucorspp.）、青霉（Penicilliumspp.）及红酵母（Rhodotorulaspp.），而优势细菌为假单胞菌属[11]。周小虎等[12]扩增细菌16S rDNA V3-V4区基因序列，研究白腐乳细菌群落结构发现，整个发酵过程中，优势微生物种群演替顺序为乳杆菌（Lactobacillus）、不动杆菌（Acinetobacter）、明串珠菌（Leuconostoc）、四联球菌（Tetragenococcus）。由此可见，通过扩增细菌16S rRNA/rDNA或是真菌ITS序列，再利用高通量测序平台分析的方法途径已较为成熟，通过该方法可明确腐乳发酵过程中微生物种群结构的演替规律。

同样，高通量测序技术也常应用于白酒生产工艺发酵过程中微生物群落结构的研究。GUO等[13]通过提取微生物的宏基因组，利用Illumina HiSeq 2000测序平台分析白酒发酵窖池中微生物群落，结果表明，发酵窖池中优势微生物群落主要为Lactobacillus、Sedimentibacter、Syntrophomonas、Methanoculleus、Methanobacterium、Bacillus、Clostridium、Galactomyces、Candida、Pichia、Penicillium和Aspergillus。LI等[14]研究汾酒发酵剂生产过程中细菌和真菌的多样性，通过细菌16S rRNA基因、真菌ITS区的扩增测序、分类和系统发育分析，发现细菌的多样性远高于真菌，Pichia kudriavzevii为主要的真菌种群，而发酵剂表面的细菌种群主要为Lactobacillaceae family，在发酵剂表面内部的主要细菌种群则为Bacillacae family。不仅如此，通过常规理化分析与高通量测序技术相结合，还可以分析微生物种群与营养物质代谢之间的关系。在某种调味白酒发酵过程中，淀粉和还原糖含量与醋酸杆菌属、芽孢杆菌属、丝衣霉属等呈正相关，与多臂菌属、毕赤酵母属等呈负相关；水分和酸度与乳杆菌、伊萨酵母属、毕赤酵母属等呈正相关，与醋酸杆菌属、芽孢杆菌属、丝衣霉属、红曲菌属等呈负相关[15]。

2.2 非发酵食品微生物检测

高通量测序技术在非发酵食品的微生物相关领域也有诸多研究和应用。丁君等[16]利用454焦磷酸测序平台的研究表明，在外套膜的微生物种群丰度和多样性上，缺刻虾夷扇贝要高于健康虾夷扇贝，且厚壁菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、放线菌门和蓝细菌门等7个细菌门类在两种虾夷扇贝中均有分布。酿酒葡萄果皮表面的微生物群落结构会直接影响葡萄酒发酵后的品质，研究发现，多个品种的酿酒葡萄果皮表面以芽孢杆菌属、小双孢菌属（Microbispora）、欧文氏菌属（Erwinia）、Kaistobacter、丙酸杆菌属（Propionibacterium）和假单胞菌属为优势细菌，以耐冷酵母属（Guehomyces）、黑附球菌属（Epicoccum）、链格孢菌属（Alternaria）、漆斑霉属（Myrothecium）、枝孢属（Cladosporium）、镰孢属（Fusarium）、隐球菌属（Cryptococcus）、茎点霉属（Phoma）和孢霉属（Mortierella）为优势真菌[17]。于国萍等[18]发现在原料乳中，乳球菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、肠球菌属（Enterococcus）为优势微生物种群，并发现了志贺菌（Shigella）及金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）两种致病菌。

2.3 食品微生物污染检测

食源性致病菌严重危害人体健康，甚至是生命安全。通过高通量测序技术，可直接明确致病菌种类及来源等，从而做到有针对性的防护措施，杜绝致病菌对食品的污染。研究人员在某地区芫荽中检测到肠胃炎、腹泻的致病菌Escherichia coli、Bacteroides fragilis、Arcobacter butzleri、Providencia alcalifaciens，检测到条件致病菌Moraxella osloensis、Acinetobacter radioresistens、Acinetobacter soli[19]。水源是微生物污染防治的重点，有研究表明，地表与地下来源的管网水中，微生物多样性差异较大，且地表来源的更为丰富[20]。因此，先了解微生物种群结构差异及来源，才能制定精准的保护和治理方法。米粉、米线是生活中常食用的食品之一，其生产和储存的环境条件都偏向于潮湿，更易于微生物的生长和繁殖。有研究显示，在米线原料和米线产品中都具有微生物的多样性，并检出了葡萄球菌属、埃希氏杆菌属和李斯特菌属[21]。高通量测序能够帮助研究食品中致病菌的存在，探明污染节点及原因，从而在各个环节中加以改善，让食品变得更加安全和健康。

3 结语

食品微生物的开发和应用是食品工业中的一把双刃剑，在丰富了发酵性食品种类及风味的同时也带来了食品安全风险。高通量测序技术的问世及其在食品微生物中的扩展应用，揭开了传统发酵食品的神秘面纱，更有益于掌控在发酵过程中对微生物多样性的利用，从而开发出更多满足人们生活新需的食品种类。同时，由致病性微生物引发的食品安全问题也变得可控，基于高通量测序技术，能够明确致病性微生物的种群结构，分析其在食品加工和储运过程中的污染节点，可精准地设计杀菌方式和环节条件，从源头避免食品安全问题的发生。随着检测技术的不断更新和发展，高通量测序技术不仅降低了检测成本，也让检测结果变得更加精确。不仅如此，通过与Q-PCR芯片技术[22]、预测微生物学软件[23]、广泛靶向代谢组学技术[24]等其他检测技术的结合，可对食品营养、安全等方面进行更多元化的分析，真正实现吃得放心、吃得健康的目标。