PelA-Expansin融合蛋白原核重组表达研究

魏玲玲, 叶凯霞, 李嘉欣, 赵庆新

(盐城师范学院 盐城市蛋白工程技术研究中心，盐城 224051)

扩张蛋白(Expansin)可以削弱或断裂植物细胞壁纤维素与半纤维素之间和半纤维素相互之间的氢键，从而使细胞壁结构疏松得以伸展[1-3]。Expansin 蛋白超级家族包含4个家族(Expansin A、Expansin B、Expansin like A和Expansin like B)[4-6]。Cosgrove实验室于1992年首次采用重组法从黄瓜下胚轴细胞壁中分离到分子质量分别为30 ku和29 ku的两个蛋白，它们能使灭活的Ⅰ型细胞壁恢复酸生长，但对Ⅱ型细胞壁无效，这两个蛋白都被命名为α-Expansin[3]。Cosgrove实验室又从玉米花粉中分离到能恢复Ⅱ型细胞壁酸生长但对I型细胞壁无效的β-expansin[7]。进一步研究发现，植物Expansin基因普遍存在于陆生植物的各个生长器官与组织中[8-9]。在与植物关系密切的线虫体[4]、真菌[10]和细菌[11]等生物体内相继发现Expansin类似蛋白。

Expansin对细胞壁的作用非常微妙，Expansin没有细胞壁水解酶活性，但共同作用可提高各细胞壁多糖水解酶的活性[2-3]。在多糖糖化工艺中，扩张蛋白可以协同纤维素酶[12]、半纤维素酶[13-14]和果胶酶[15-16]等多糖降解酶降解多糖，提高可发酵性糖类产量[17]；另外，医药领域和多糖降解酶联用，可提高功能性药物成分的提取效率[18]。枯草芽孢杆菌Expansin基因的发现[11]，为通过基因工程技术构建Expansin的高效表达原核工程菌研究提供有效的备选基因。目前，枯草芽孢杆菌 Expansin 的重组表达在表达效率、活性和稳定性等方面，还存在诸多需要改进和提高之处。Kim等[11]在该蛋白的C-terminus 添加 6-His tag进行原核表达，测得与纤维素酶的协同活性为 240%，但产量并不高。Chen 等[19]对多种细菌来源的Expansin进行了重组表达，包括枯草芽孢杆菌Expansin，得到的重组蛋白与纤维素酶之间的协同效率为15%～42%。LIN 等[20]采用了相同的方法进行 BsEXLX1 的重组表达，重组的BsEXLX1蛋白产量虽有所提高，但与纤维素酶的协同活性低于80%。叶凯霞等[21]在枯草芽孢杆菌Expansin蛋白两端分别添加6-His tag，将表达量提高到约为 1.2 mg/mL，重组蛋白与纤维素酶、木聚糖酶和果胶酸水解酶的协同效率分别为171%、62%和230%。

为进一步提高Expansin促进植物细胞壁降解和多糖糖化，以构巢曲霉(Aspergillusnidulans)果胶酸裂解酶(Pectate lyase A，PelA)基因[22]构建的融合表达载体pelA-pET28-a(+)，研究PelA-Expansin融合蛋白的表达，同时具备果胶酶的功能，为植物细胞壁降解和多糖糖化提供更好的辅助蛋白因子。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株

克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；表达载体pelA-pET-28a(+)为本实验室构建；大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、工程菌expansin/pMD18-T/DH5α以及expansin/pET-28a(+)/DH5α等为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂与培养基

各种基因工程酶与抗生素均购自宝生物工程(大连)有限公司；相关纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和木聚糖等多糖降解酶购自美国 Sigma-Aldrich 公司；木聚糖与果胶酸购自美国 Sigma-Aldrich公司；羧甲基纤维素钠购自国药集团；镍离子金属鏊合柱(Ni-NTA)购自Novagen公司。

LB-Amp固体培养基制备：LB固体培养基灭菌后，冷却至65 ℃以下，加入氨苄青霉素至终质量浓度为100 μg/mL。LB-Kan固体培养基：LB固体培养基灭菌后，冷却至65 ℃以下，加入卡纳霉素至终质量浓度为100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因工程菌newexpansin/pMD18T/DH5α构建

Bacillussubtilissubsp.subtilis str.168的expansin-YoaJ 基因(No: NC_000964.3)，全长699 bp，包含N-terminus 75 bp 的信号肽。酶切位点分析结果显示第77～82个碱基为NdeI酶切位点(CATATG)，与表达载体pelA-pET-28a(+)上需要使用的NdeI位点重复，需要消除。在expansin基因合成上游引物设计中消除其内部的NdeI，同时在上游引物的5′端添加NdeI位点，故上游引物为BsE1 5′-CATATGGCATACGACG-ACCTGCATGAAGG-3′(5′含NdeI)，下游引物为BsE2 5′-GAATTCTTCAGGAAACTGAACATGG-3′(5′含EcoR I)。过夜培养天然枯草杆菌expansin基因克隆工程菌(expansin/pMD18-T/DH5α)菌株，以提取质粒(expansin/pMD18T)作为模板，使用引物 BsE1和BsE2，PCR 合成基因newexpansin；纯化后与克隆载体 pMD18-T 连接，获得克隆质粒newexpansin/pMD18T，转化感受态细胞DH5α，涂布于 100 μg/mL Amp 平板上以筛选转化子，得到newexpansin/pMD18T/DH5α克隆工程菌；提取克隆质粒，经双酶切鉴定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.2 新扩张蛋白目标工程菌newexpansin/pelA-pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建

培养newexpansin/pMD18T/DH5α，提取newexpansin/pMD18T，用限制性内切酶NdeI和EcoR I双酶切，得到newexpansin片段。培养pelA-pET-28a(+)/DH5α，提取pelA-pET-28a(+)，用限制性内切酶NdeI和EcoR I双酶切，得到pelA-pET-28a(+)片段；pelA-pET-28a(+)与newexpansin连接，将连接产物热激转化感受态细胞DH5α，涂布于LB-Kan平板上，挑取阳性转化子，进行菌落PCR鉴定以及提取重组质粒进行双酶切鉴定，鉴定正确，得到工程菌newexpansin/pelA-pET-28a(+)/DH5α,提取newexpansin/pelA-pET-28a(+)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到新扩张蛋白的目标工程菌newexpansin/pelA-pET-28a(+)/BL21(DE3)(缩写为pelA-expansin/BL21)。

1.2.3 PelA-Expansin的表达与优化

将工程菌pelA-expansin/BL21接种于5 mL LB液体培养基中(含100 μg/mL Kan)，于培养箱中37 ℃、200 r/min培养12 h以活化菌种。然后将已活化的菌液按1%的接种量转接至100 mL的LB液体培养基中(含100 μg/mL Kan)，继续在37 ℃、200 r/min的条件下培养一段时间，分别在不同条件下进行诱导表达。优化OD600选择0.4、0.6、0.8和1.0，以0.01 mmol/L IPTG诱导，15 ℃表达24 h。诱导剂IPTG浓度优化选择0.010、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L，在OD600为0.4时诱导，于15 ℃表达24 h。表达温度优化，诱导OD600为0.4时，加入0.01 mmol/L IPTG，分别于10 ℃、15 ℃和20 ℃表达24 h，于25 ℃和30 ℃表达12 h，于35 ℃和37 ℃表达6 h。表达时间优化，菌浓OD600为0.4时，加入0.01 mmol/L的IPTG，15 ℃分别表达6、12、18、24、30、36、42和48 h。

1.2.4 PelA-Expansin融合蛋白活性的检测

0.5 mL反应液含 50 mmol/L 乙酸钠(pH 5.0)、3 mg/mL羧甲基纤维素钠、适量的纤维素酶及PelA-Expansin蛋白溶液，40 ℃反应 12 h，加入0.5 mL的DNS试剂，100 ℃煮沸10 min，于540 nm 处检测光吸收值[23]。配制葡萄糖标准溶液，制作葡萄糖标准曲线，根据葡萄糖标准曲线计算反应液中的还原糖(Reducing sugar，RS)产量。比较不同体系中还原糖的产生量。

1.2.5 PelA-Expansin融合蛋白的分离纯化

将工程菌pelA-expansin/BL21于最佳表达条件进行表达，结束后6 000 r/min离心10 min收集菌体进行超声破碎，将破碎液于4 ℃、10 000 r/min离心30 min取上清液，该上清液为含有融合蛋白PelA-Expansin的粗蛋白溶液。融合蛋白PelA-Expansin初步纯化方法包含Ni-NTA Column制备、平衡、上样、清洗和洗脱，参照说明书进行，分类优化后蛋白纯化工艺中上样、清洗和洗脱缓冲液中咪唑浓度分别为30、60和500 mmol/L。

1.2.6 SDS-PAGE

为了检测重组菌表达的重组蛋白产物，采用SDS-PAGE凝胶电泳检测，浓缩胶质量分数为35%，分离胶质量分数为11%，用考马斯亮蓝R250染色[24]。蛋白含量的测定参照Bradford的方法采用考马斯亮蓝G250法进行可溶性蛋白含量测定[25]。以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，配制标准溶液，制作标准曲线。

2 结果与分析

2.1 newexpansin基因的定点突变与表达质粒构建

以BsE1(包含NdeI位点的突变)、BsE2为引物，前期构建的表达质粒expansin/pET-28a(+)为模板，PCR扩增newexpansin基因，经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR所得产物条带大小符合预期结果，共633 bp[图1(a)]。待连接的表达载体质粒newexpansin/pelA-pET-28a(+)的双酶切见图1(b)。

(a)M为DNA标记; 1、2为newexpansin基因的PCR产物；(b)M为DNA标记; 1为newexpansin/ pelA-pET-28a(+)对照；2、3为双酶切newexpansin/pelA-pET-28a(+)(Nco I+Eco RⅠ)

2.2 融合蛋白PelA-Expansin的表达与优化

在OD600为0.4，0.01 mmol/L IPTG，15 ℃和150 r/min条件下，表达24 h，融合蛋白产量约为3.0 mg/mL。

2.3 融合蛋白PelA-Expansin的纯化

融合蛋白PelA-Expansin最佳纯化条件为柱床体积为6 mL的条件下，上样缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，30 mmol/L咪唑，pH 8.0)，用量为60 mL；清洗缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，60 mmol/L咪唑，pH 8.0)，用量为45 mL；洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 8.0)，用量为30 mL。最终从1 L的菌液中分离纯化得到了约225 mg融合蛋白PelA-Expansin，产量较前人研究有显著提高，并且得到的融合蛋白PelA-Expansin纯度高达95%[图2(b)]，得率为75%。

(a)M为蛋白质标记; 1为无IPTG培养物的可溶性片段; 2为最佳表达条件下培养的可溶性片段。(b)1为培养基中未添加IPTG的蛋白样本；2为纯化前总蛋白样本；3为30mmol/L咪唑缓冲液洗脱纯化后蛋白；4为60 mmol/L咪唑缓冲液(1×洗脱缓冲液)洗脱纯化后蛋白；5～9分别为浓度为100、200、300、400及500 mmol/L咪唑缓冲液洗脱纯化后的蛋白。

2.4 融合蛋白PelA-Expansin活性检测

反应条件为37 ℃、pH 5.0、反应4 h，对照组为Buffer对照及PelA-Expansin对照，反应组为PelA-Expansin与多糖酶协同反应组和多糖酶独立反应组。融合蛋白PelA-Expansin融合蛋白协同纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶联合降解对应多糖，降解效率分别提高300%、150%和125%(表1)。

图3 OD600、IPTG、温度和时间对融合蛋白PelA-Expansin表达的影响

表1 PelA-Expansion与多糖酶的协同效应

3 讨论与结论

PelA-Expansin表达量达到3.0 mg/mL，与6His-Expansi-6His的表达水平(1.2 mg/mL)相比较，提高了1.5倍[21]。PelA-Expansin、6His-Expansin-6His和Expansin-6His蛋白表达差异是PelA-Expansin表达产物无包涵体蛋白，6His-Expansin-6His表达产物有微量包涵体，Expansin-6His表达产物主要为包涵体，PelA可能有利于提高蛋白的可溶性。在PelA-Expansin表达优化的过程中发现，低浓度的IPTG和低温更利于融合蛋白PelA-Expansin表达。引起这种现象的原因是较高IPTG浓度和温度使得目标蛋白表达过快，大部分目标蛋白虽然为可溶性状态但尚未能正确折叠，导致大部分上清液中的蛋白不具备活性，低浓度IPTG和低温可能更利于蛋白的有效折叠。

PelA-Expansin与纤维素酶的协同活性达到了300%，Kim等[11]表达的Expansin与纤维素酶的协同活性为240%，PelA-Expansin与纤维素酶的协同活性较高于前人的研究水平；PelA-Expansin与果胶酶的协同性在数据上低于叶凯霞等[21]的报道水平，其原因是PelA-Expansin本身就是果胶酶和Expansin的融合蛋白，能够降解果胶酸水解酶的底物多聚半乳糖糖醛酸。

研究结果表明，构巢曲霉果胶酸裂解酶A融合在枯草芽孢杆菌Expansin的N端，能有效改进其在大肠杆菌中的表达(3.0 mg/mL)，PELA-Expansin融合蛋白与纤维素酶、木聚糖酶和果胶酸水解酶等多糖降解酶之间有较好的协同作用，建立的PELA-Expansin一步纯化工艺所得的目标蛋白纯度较高(约95%)，得率较高(约75%)。本研究为枯草芽孢杆菌Expansin蛋白在食品、能源、医药及农业等领域的工业化应用奠定了基础。