多环芳烃降解菌的筛选及降解特性分析

甄 静，李 磊，王继雯，杨文玲，杜志敏，李亮亮，巩 涛

(1.河南省微生物工程重点实验室，郑州 450008；2.河南省科学院生物研究所有限责任公司，郑州 450008)

多环芳烃(PAHs)是一种广泛存在于环境中的毒性有机化合物[1]，很多PAHs会在生物体内积累，通过细胞毒性、遗传毒性和免疫毒性对生物体产生致癌、致畸、致突变作用[2-3]，对自然界生物安全和人类健康造成巨大威胁。多环芳烃主要来源于生活中有机物的不完全燃烧(原油和煤炭)和各项的工业活动(化石燃料的提炼过程)[4-5]。近几年来由于城市化和工业化速度的不断加快，多环芳烃的污染形势更加严峻，而且多环芳烃具有易迁移、难降解和生物积累等特性，在生态系统中可以不断循环。因此，如何有效治理多环芳烃污染一直是世界各国所面临的重大环境问题。

在多环芳烃的污染土壤中，多环芳烃的污染形式逐渐趋于复杂化和多元化，污染物多以复合污染的形式存在。重金属(heavy metal, HM)作为典型的无机污染物，不能被降解，只能被转化，在环境中常与PAHs共存形成复合污染[6]。两种污染物同时存在于同一环境时发生各种直接或间接的相互作用，使其毒性大于单一污染物所产生的效应之和[7]，进而增加多环芳烃污染修复的难度。

生物修复作为重金属和多环芳烃单一污染的重要修复手段，在两者复合污染的PAHs修复中同样因其成本低、无二次污染等优势被人们所重视[8-9]，其中微生物的转化和降解一直是被认为比较有效地去除和降解多环芳烃的实用方法[10]。研究发现在微生物修复复合污染PAHs的过程中，由于重金属的毒性，微生物对复合污染中PAHs的去除和降解效果被减弱，有些微生物甚至不具备降解能力[11-12]。而且两者复合污染位点经常伴随着土壤酸碱度的变化或营养物质的缺乏，土壤酸碱的不确定性或营养物质缺乏通过影响修复位点的生理生化性质和生态系统进而影响微生物对复合污染物的修复和降解[13-15]。因此，筛选出在这些不良环境中能够很好降解多环芳烃的菌株尤为重要，目前国内在这方面的研究少有报道。

在复合污染中，重金属和多环芳烃的种类往往不止一种，所以本试验根据实际污染情况有针对性地进行微生物降解菌株的筛选，选用多环芳烃菲和芘、重金属Cu2+和Cr6+进行微生物菌株的筛选，并进一步筛选能够耐受不良pH和营养物质缺乏的菌株，然后分析筛选菌株在这些不良环境中对多环芳烃菲和芘的降解效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土样

污染土样采自南阳长期受石油污染的土壤。采集表层0～8 cm的土壤，装入无菌自封袋中，封口并带回实验室，该污染土样用于菌株的筛选。

1.1.2 培养基

M9液体培养基(1 L)[16-17]：Na2HPO46 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，加入2.5 mL营养液，pH 7.2。营养液(1 L)组成：MgCl210.75 g，CaCO32.0 g，FeSO44.5 g，ZnSO41.44 g，MnSO41.12 g，CuSO40.25 g，CoSO40.24 g，H3BO40.06 g，HCL 51.3 mL。固体培养基加入1.5%琼脂粉。菲和芘用正己烷配置成母液，用0.22 μm有机滤膜过滤灭菌后加入灭好菌的M9培养基中作为唯一碳源。

OMM培养基(1 L)[18]: KH2PO40.1 g，Na2HPO40.1 g，NH4NO30.5 g，NH4SO40.5 g，MgSO40.2 g，CaCl20.02 g，FeCl20.002 g，MnSO40.002 g，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选

(1)富集培养及分离。新鲜土壤样品过2 mm筛子，准确称取10.00 g，加入50 mL的M9液体培养基中，放入摇床180 r/min，25 ℃培养24 h，取5 mL上层培养液转接于45 mL M9液体培养基中，该培养基中含有质量浓度各为250 mg/L的菲和芘，当看见微生物增长明显时，再次取5 mL培养液转接到含有菲和芘的新鲜的M9培养基中，经过几次的转接培养后梯度稀释，取0.1 mL梯度稀释的培养液涂布于M9固体培养基上，固体培养基含有100 mg/L菲和100 mg/L芘，放置于培养箱37 ℃培养。待长出菌落后挑取培养基上的细菌平板划线得出细菌单菌落。

(2)耐不良环境菌株的筛选。重金属分析：分别用去离子水配置10 g/L Cr6+和1 g/L Cu2+母液。挑取上述筛选出的单菌落接种于OMM固体培养基中，在培养基中加0.5%葡萄糖作为唯一碳源，分别加入重金属Cr6+和Cu2+，使Cr6+和Cu2+终质量浓度各为40 mg/L，于培养箱25℃培养1～3 d，观察菌株的生长情况。

pH分析：用过滤灭菌的HCl将M9固体培养基的pH值调至7.4和5.0。挑取上述筛选出的单菌落接种于pH值分别为7.4和5.0的M9固体培养基中，在培养基中加入0.5%葡萄糖作为唯一碳源，观察菌株的生长情况。

营养缺乏分析：用Ca3(PO4)2代替M9固体培养基中的NH4Cl，pH 7.4，其他成分不变，培养基中加入0.5%葡萄糖作为唯一碳源。

1.2.2 菌株重金属、pH和营养缺乏耐性分析

在上述研究的基础上，考察重金属、pH及营养缺乏对菌株生长的影响。180 r/min，25 ℃进行摇床培养，在不同时间段取培养液，用96孔板测定OD600以检测菌株的生长情况。

1.2.3 菌株鉴定

挑取单菌落接种于LB培养基中，180 r/min，37 ℃培养24 h，用菌液直接进行PCR扩增。用于PCR扩增反应的引物序列：前引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，后引物 1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min；94℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环。PCR 反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测后送华大基因公司进行测序分析。将测序结果在GenBank中用Blast进行同源性比较。

1.2.4 菌株在不良环境中对PAHs的降解分析

菌液的制备：从M9固体培养基中挑取菌株F3-1，接种于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃，摇床培养16～24 h后离心弃上清液，加入含有0.5%葡萄糖的M9液体培养基使菌液的OD600为1.0备用。该M9液体培养基中用Ca3(PO4)2代替NH4Cl，同时加入重金属离子Cr6+和Cu2+，Cr6+和Cu2+终质量浓度各为20 mg/L，pH 5.0和7.4。

用正己烷分别配备质量浓度为150 mg/L的菲或芘标品，在棕色玻璃瓶中加入1 mL菲或芘标品溶液，待正己烷完全挥发后，取OD600=1.0的3 mL细胞菌液加入棕色玻璃瓶中，对照处理组为加入3 mL相同质量浓度的灭活菌液，置于25 ℃，180 r/min，恒温摇床培养5 d进行降解实验，每批样品3组平行样。降解率=(对照样质量浓度-降解样质量浓度)/对照样质量浓度×100%。

1.2.5 样品预处理及HPLC分析

液相样品预处理：萃取相用色谱级的正己烷，每个样品加入3 mL正己烷萃取，旋涡振荡10 min，摇床振荡20 min后静置，待样品分层稳定后，取上层有机相并加入一定量的无水硫酸钠脱水，然后将此有机相用0.22 μm的滤膜过滤。

HPLC分析：采用安捷伦 LC-1200 型高效液相色谱仪测定PAHs含量。样品注入量为20 μL，分离柱为 ZORBAX SB-C18 column(0.46 mm×150 mm，安捷伦)，柱温30 ℃，紫外检测波长254 nm，流动相为乙腈和水(体积比为 80∶20)，流速1.0 mL/min。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

通过多次的富集培养和分离纯化，从污染土壤中共筛选出14株细菌，这些细菌能够在以菲和芘为唯一碳源时生长。将各个菌株进行分子生物学鉴定，结果显示，所分离的菌株分别属于假单胞菌、副球菌属、博代氏杆菌属、无色杆菌属、鲍特氏菌和根瘤菌属。

为了能够获得耐受不良环境的实用性菌株，通过平板培养分析各个菌株的重金属、pH和营养缺乏耐性，从中获得2株较好的耐受3种不良环境菌株F3-1和B3-1，两种菌株相比，F3-1在平板上的生长状况优于B3-1，所以选用F3-1进一步分析研究。菌株F3-1在培养基及显微镜下的形态见图1和图2。从图1可以看出，菌株F3-1为白色的圆形菌落，边缘平整，表面光滑湿润，革兰氏染色呈阴性，显微镜下菌落形态为短杆状。为了进一步确定该菌的分类地位，在形态学的基础上又进行了分子生物学鉴定，用设计的引物扩增并进行16S rDNA基因测序，将得到的序列与GenBank中已知序列进行对比，选取同源性较近的模式菌株进行系统发育分析，结果见图2。序列对比表明，菌株F3-1与根瘤菌属Rhizobiumpusense的序列相似性为99%，因此鉴定该菌株F3-1属于根瘤菌。

图1 菌株F3-1在LB培养基及显微镜下的形态(100×)

图2 菌株F3-1与相关菌株的系统发育树

2.2 菌株F3-1的重金属、pH和营养缺乏耐性分析

2.2.1 菌株F3-1重金属耐性分析

所选的重金属Cr6+质量浓度为0、1、3、5、7、10、20、50和100 mg/L，考察该菌株对重金属Cr6+的耐受性，结果见图3。从图3可以看出，菌株在Cr6+质量浓度为0～20 mg/L时均可以正常生长。当Cr2+质量浓度为50 mg/L时，菌株生长受到抑制；而当Cr6+质量浓度为100 mg/L时，菌株几乎没有生长。可以看出，菌株F3-1可以耐受重金属Cr6+的质量浓度为20 mg/L。

图3 菌株F3-1在不同Cr6+质量浓度下的生长曲线

Cu2+离子质量浓度分别设置为0、2、4、6、8、10、20和40 mg/L，结果见图4。从图4可以看出，菌株在Cu2+离子质量浓度为0～20 mg/L时均可以正常生长。当Cu2+质量浓度为40 mg/L时，菌株生长受到抑制。因此，菌株F3-1可以耐受Cu2+离子质量浓度为20 mg/L。

图4 菌株F3-1在不同Cu2+质量浓度下的生长曲线

2.2.2 菌株F3-1 pH耐受性分析

考察菌株F3-1在强酸性(pH 5.0)和中性(pH 7.4)条件下的生长状况，结果见图5。从图5可以看出，无论是强酸性环境还是中性环境，菌株F3-1均可以正常生长，说明该菌株F3-1能够耐受酸性及中性的环境。

图5 菌株F3-1在不同pH条件下的生长曲线

2.2.3 菌株F3-1 营养缺乏分析

根瘤菌在纯培养中的自生固氮作用已有许多报道[15]，这种纯培养的培养基均需有各种大量的和微量的无机盐、碳源、维生素等。在缺乏氮源M9培养基上分析菌株的生长情况，结果见图6。结果表明，菌株F3-1在缺乏氮源的液体培养基中可以正常生长，受氮源缺乏的影响较小。

图6 菌株F3-1营养缺乏耐受性分析

2.3 菌株F3-1在不良环境中对PAHs降解效果

在缺乏氮源以及重金属Cr6+和Cu2+终质量浓度各为20 mg/L的条件下，分析菌株F3-1在强酸性pH 5.0和中性pH 7.4条件下对菲和芘的降解效果，结果见图7。从图7可以看出，菌株F3-1在强酸性pH 5.0和中性pH 7.4条件下均可以降解菲和芘，但降解效果有一定的差异，菌株F3-1在中性条件下对菲表现出较好的降解能力，在强酸性条件下对芘的降解效果较好，5 d后菌株F3-1在pH 7.4时对菲的降解率为35.54%，在pH 5.0时对芘的降解率为53.43%。

图7 菌株F3-1对PAH降解效果

3 讨论与结论

目前高效降解PAHs的微生物菌株和菌群已有大量的研究报道，这些微生物在较短的时间内能够达到很好的PAHs降解效果，但这些都依赖于环境中可行的物理条件，比如pH、温度和充分营养条件等，因为只有在合适的环境中微生物才能够正常生长和保持活性[19]。而在现实环境中往往受到各种不利条件的影响，如PAHs污染土壤的pH呈现从酸性到中性的变化，环境中其他污染物如重金属能够加剧多环芳烃对微生物细胞的毒害作用[20]，再者氮源的不足也降低微生物对多环芳烃的降解。因此，本研究利用多种培养基从多环芳烃污染土壤中筛选得到14株能够以菲和芘为唯一碳源生长的细菌菌株，并从14株细菌中分离到1株较好的耐受重金属、极端pH和营养缺乏的多功能细菌F3-1，通过形态学观察和16 S rDNA基因序列比对确定该菌株与根瘤菌属中Rhizobiumpusense的同源性最近，因此确定该菌株属于根瘤菌。研究表明，根瘤菌不但具有较好的有机污染物降解和抗重金属的能力，而且还可以诱导刺激其他降解菌的生存和降解能力，从而在更大程度上提高对污染物的降解效果[21]。

多环芳烃污染源的土壤大多以复合污染的形式存在，其中多环芳烃和重金属属于环境中最常见的复合污染。一方面，复合污染中重金属的存在导致多环芳烃降解菌降解能力大大降低，甚至无法存活[22]，本研究选用OMM培养基分析各个菌株对Cr6+和Cu2+两种重金属的耐受性，与其它培养基相比，OMM培养基较少影响游离重金属的毒性，从而使重金属的毒性更大[6]，结果发现4株菌株能够在质量浓度分别为40 mg/L的Cr6+和Cu2+中正常生长；另一方面，在重金属污染区域往往存在养分不足的问题，营养成分的不足大大减少PAH降解菌的数量，营养物质已经被认为是影响多环芳烃生物降解的一个最重要因素，而氮素的极端不足又是养分不足的核心问题[23]。本研究考察各个菌株在氮源缺乏培养基的生长状态，发现有2株菌株能够较好地生长，进一步分析这两种菌株在酸性培养基上的生长状态，发现这两种菌株也可以正常生长，综合上述菌株在各个培养基的生长状态，分离到1株较好的耐受重金属、极端pH和营养缺乏的多功能菌株根瘤菌F3-1；进一步分析该根瘤菌F3-1在两种重金属Cr6+和Cu2+、氮源缺乏及极端pH环境中的生长曲线，结果表明根瘤菌F3-1在质量浓度为20 mg/L Cr6+和20 mg/L Cu2+的环境中正常生长，氮源缺乏对该菌株的生长影响也较小，根瘤菌F3-1能够在强酸性(pH 5.0)和中性(pH 7.4)环境中正常生长。

本研究利用上述筛选到的耐受各种不良环境的根瘤菌F3-1，分析其在重金属以及氮源缺乏等多种不利环境中对多环芳烃菲和芘的降解效果，结果表明，5 d后该根瘤菌F3-1在重金属Cr6+和Cu2+(质量浓度均为20 mg/L)及缺乏氮源的情况下对菲和芘均有很好的降解效果，且根瘤菌F3-1在强酸性和中性环境中均可以降解菲和芘，但存在一定的差异性，在中性环境中对菲表现出较好的降解能力，在酸性环境中对芘的降解效果较好。目前在中性环境中菌株降解多环芳烃已经得到了广泛的研究[24]，而微生物能够在强酸性环境中降解多环芳烃的研究报道较少，本研究筛选的根瘤菌F3-1能够在强酸性条件(pH 5.0)下降解菲和芘，为多环芳烃污染土壤的生物修复提供宝贵的微生物资源。