脓毒症患者外周血miR⁃98⁃5p与全身炎症反应激活及预后的相关性研究

巫兴阳 汪飞★ 杨呈浩 黄小勇 舒燕

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，容易引起多器官功能障碍，病情凶险、死亡率高、救治难度大［1⁃2］。全身炎症反应的级联放大激活是脓毒症重要的病理生理特征［3］，但调控炎症反应的机制复杂且未完全阐明。微小RNA（microRNA，miR）是现代生物医学研究的热点分子，具有广泛的生物学作用，不仅能够作为评估病情的标志物，还能作为研究发病机制和防治手段的靶点。根据国内唐晋的动物实验研究，脓毒症大鼠肺组织中miR⁃98⁃5p 的表达降低，过表达miR⁃98⁃5p 通过靶向抑制Toll 样受体4（Toll like re⁃ceptor 4，TLR4）信号通路中TRAF6 的表达介导抗炎效应，能够使多种炎症细胞因子的释放减少［4］，提示miR⁃98⁃5p 可能在脓毒症的发病通过抗炎效应起到保护作用。本研究将miR⁃98⁃5p 作为外周血标志物用于脓毒症病情的评估，具体分析脓毒症患者外周血miR⁃98⁃5p 与全身炎症反应激活及预后的相关性，旨在为发现评估脓毒症病情的新手段、研究脓毒症发病机制的新靶点提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年1月至2021年1月期间自贡市第四人民医院收治的102 例脓毒症患者作为脓毒症组，另取同期本院体检的100 例健康志愿者作为对照组。脓毒症组中男性62 例、女性40例，年龄平均（47.61±10.23）岁；对照组中男性60例、女性40 例，年龄平均（45.68±9.39）岁。两组间一般资料的比较差异无统计学意义（P>0.05）。

纳入标准：①符合《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南（2018）》［5］中脓毒症的诊断标准；②临床资料完整；③外周血及血清临床样本完整。排除标准：①入院后48 h 内死亡；②合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、原发性肝肾疾病。本实验经所有入组者知情同意，本实验经医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miR⁃98⁃5p 表达的检测

入院后立即采集脓毒症患者的肘静脉血2～3 mL，体检时采集志愿者的肘静脉血2～3 mL，采用试剂盒进行miR 提取、cDNA 反转录合成、荧光定量PCR 检测，均按照试剂盒说明书进行操作，分别对miR⁃98⁃5p 和U6 进行荧光定量PCR 检测，根据检测得到的反应的循环曲线及循环阈值（Ct），代入公式2⁃ΔΔCt计算miR⁃98⁃5p 的表达水平。根据结果计算脓毒症患者miR⁃98⁃5p 表达的中位数并分为miR⁃98⁃5p 表达≥中位数患者与miR⁃98⁃5p 表达<中位数患者。

1.2.2 脓毒症病情的评估

参照《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南（2018）》［5］，根据入院后48 h 内一般资料、实验室检查的最差值计算急性生理和慢性健康评分Ⅱ（Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ，APACHEII）［5］、序贯性器官衰竭评分（sequential or⁃gan failure assessment，SOFA）［5］。

1.2.3 血清炎症细胞因子含量的检测

入院后立即采集脓毒症患者的肘静脉血2～3 mL，静置凝血后离心分离血清，采用酶联免疫吸附法试剂盒（上海酶联公司）检测炎症细胞因子肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、白介素⁃1β（interleu⁃kin⁃1β，IL⁃1β）的含量。

1.2.4 预后的评价

根据28 d 的生存情况评估预后，结局分为生存和死亡。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行数据统计，计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验；28 d 累积生存率采用K⁃M 曲线表示，两组间比较采用log⁃rank检验；预后的预测采用ROC 曲线分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脓毒症组与对照组外周血miR⁃98⁃5p表达的比较

脓毒症组患者外周血miR⁃98⁃5p 的表达水平与对照组比较明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 脓毒症组与对照组外周血miR⁃98⁃5p表达的比较（±s）Table 1 Comparison of miR⁃98⁃5p expression in peripheral blood between sepsis group and control group（±s）

表1 脓毒症组与对照组外周血miR⁃98⁃5p表达的比较（±s）Table 1 Comparison of miR⁃98⁃5p expression in peripheral blood between sepsis group and control group（±s）

组别脓毒症组对照组t 值P 值n 102 100 miR⁃98⁃5p 表达水平0.67±0.18 1.00±0.26 10.506 0.000

2.2 脓毒症组中不同miR⁃98⁃5p 表达患者APA⁃CHEII、SOFA 评分的比较

脓毒症组中miR⁃98⁃5p 表达≥中位数患者的APACHEII、SOFA评分与miR⁃98⁃5p表达<中位数患者比较明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 脓毒症组中不同miR⁃98⁃5p 表达患者APACHEII、SOFA 评分的比较（±s）Table 2 Comparison of APACHE II and SOFA scores between patients with different miR⁃98⁃5p expression in sepsis group（±s）

表2 脓毒症组中不同miR⁃98⁃5p 表达患者APACHEII、SOFA 评分的比较（±s）Table 2 Comparison of APACHE II and SOFA scores between patients with different miR⁃98⁃5p expression in sepsis group（±s）

miR⁃98⁃5p 表达≥中位数<中位数t 值P 值n 51 51 APACHEII 评分21.31±5.42 25.14±7.61 2.925 0.004 SOFA 评分8.47±2.36 10.57±2.85 4.053 0.001

2.3 脓毒症组中不同miR⁃98⁃5p 表达患者血清炎症细胞因子的比较

脓毒症组中miR⁃98⁃5p 表达≥中位数患者的血清TNF⁃α、HMGB⁃1、IL⁃1β 含量与miR⁃98⁃5p 表达<中位数患者比较明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 脓毒症组中不同miR⁃98⁃5p 表达患者血清炎症细胞因子的比较（±s）Table 3 Comparison of serum inflammatory cytokines between patients with different miR⁃98⁃5p expression in sepsis group（±s）

表3 脓毒症组中不同miR⁃98⁃5p 表达患者血清炎症细胞因子的比较（±s）Table 3 Comparison of serum inflammatory cytokines between patients with different miR⁃98⁃5p expression in sepsis group（±s）

miR⁃98⁃5p表达≥中位数<中位数t 值P 值n 51 51 TNF⁃α（ng/mL）7.68±1.52 10.44±2.76 6.256 0.000 HMGB⁃1（pg/mL）94.57±16.85 132.45±24.67 9.055 0.000 IL⁃1β（ng/mL）10.15±2.91 13.47±3.46 5.244 0.000

2.4 脓毒症组中不同miR⁃98⁃5p 表达患者28 d 累积生存率的比较

miR⁃98⁃5p 表达≥中位数患者共7 例发生死亡、miR⁃98⁃5p 表达<中位数患者共31 例发生死亡，脓毒症组中miR⁃98⁃5p 表达≥中位数患者的28 d累积生存率与miR⁃98⁃5p 表达<中位数患者比较明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 脓毒症组中不同miR⁃98⁃5p 表达患者28 d 累积生存率的比较Figure 1 Comparison of 28 d cumulative survival rate between patients with different miR⁃98⁃5p expression in sepsis group

2.5 miR⁃98⁃5p 表达预测脓毒症患者预后的ROC曲线分析

外周血miR⁃98⁃5p 表达预测脓毒症患者预后的，曲线下面积为0.777，诊断的临界值为0.664，相应的灵敏度为89.19%（95%CI：74.58～96.97%）、特异性为64.06%（95%CI：51.10～75.68%）。见图2。

图2 ROC 曲线图Figure 2 ROC curve

3 讨论

脓毒症的病情凶险、死亡率高，起病早期准确评估病情、判断预后对于指导治疗具有积极意义。近些年，随着对脓毒症发病机制研究的不断深入，多种生物标志物被证实对脓毒症的病情及预后具有判断价值。miR 是一类长度18⁃25 核苷酸的非编码小分子RNA，广泛分布于体内各个脏器和组织，在细胞增殖和分化、炎症反应、氧化应激等生物学环节中均起到调控作用。miR⁃98⁃5p 是一种具有抑炎作用的miR，在脓毒症［4，6］、炎症性肠病［7］、系统性红斑狼疮［8］等炎症相关疾病的动物模型中表达减少，本研究结果提示miR⁃98⁃5p 有望作为评估脓毒症病情的标志物。

在多种炎症相关疾病中，miR⁃98⁃5p 对肺脏、肠道等组织具有保护作用。在脓毒症的病情发展变化过程中容易发生多脏器功能障碍，临床上常用APA⁃CHEII、SOFA 评估脓毒症的病情严重程度，能够综合评估生命体征、脏器功能［9⁃10］。本研究分析了脓毒症患者miR⁃98⁃5p 表达水平与APACHEII、SOFA 的关系，以此反映miR⁃98⁃5p 表达与脓毒症病情的相关性。根据miR⁃98⁃5p 表达水平的中位数将脓毒症患者分为miR⁃98⁃5p 表达<中位数及miR⁃98⁃5p 表达≥中位数的患者，分析结果显示：随着miR⁃98⁃5p 表达增加，脓毒症患者的APACHEII、SOFA 评分随着降低，表明在脓毒症的发病过程中较高的miR⁃98⁃5p表达水平具有保护作用、能够使脓毒症的病情减轻。

TLR4通路是脓毒症发病过程中调控炎症反应级联放大激活的重要通路，根据国内唐晋［4］的动物实验研究，miR⁃98⁃5p 对脓毒症大鼠肺组织中TLR4 通路分子TRAF4 的表达具有靶向抑制作用，进而能够抑制TNF⁃α、IL⁃1β 等炎症细胞因子的释放并起到抑炎作用。脓毒症相关的临床研究已经证实，TNF⁃α、HMGB⁃1、IL⁃1β 是与脓毒症病情发展密切相关的炎症细胞因子，脓毒症患者血清中上述细胞因子的含量明显增加［11⁃13］。本研究通过分析分析了脓毒症患者miR⁃98⁃5p 表达水平与炎症细胞因子的关系，以此反映miR⁃98⁃5p 表达与脓毒症发病过程中全身炎症反应激活的关系，结果表明在脓毒症的发病过程中较高的miR⁃98⁃5p表达水平具有抑炎作用，能够减轻全身炎症反应的激活及多种炎症细胞因子的释放。

28 d 生存情况是评估脓毒症预后的常用方式，多项临床研究证实APACHEII、SOFA 是脓毒症患者预后的独立影响因素［14⁃16］。本研究在证实miR⁃98⁃5p 与脓毒症病情及炎症反应相关后，进一步分析了miR⁃98⁃5p 与预后的关系。经K⁃M 曲线分析28 d 累积生存率的差异可知：与miR⁃98⁃5p 表达<中位数的脓毒症患者比较，miR⁃98⁃5p 表达≥中位数的脓毒症患者28 d 累积生存率明显增加，表明在脓毒症的发病过程中较高的miR⁃98⁃5p 表达水平能够改善预后、提高28d 生存率。进一步通过ROC曲线分析miR⁃98⁃5p 对预后的预测价值可知：miR⁃98⁃5p 能够预测脓毒症患者的28 d 生存情况。

综上所述，脓毒症患者外周血miR⁃98⁃5p 表达降低与病情加重、全身炎症反应激活及预后不良有关，未来miR⁃98⁃5p 有望成为评估脓毒症病情及预后的标志物，也可作为研究脓毒症发病机制及防治手段的靶点。