萌发对小粒黑豆活性组分及抗氧化能力的影响研究

刘宏瑀，宋艳丽，王可心，高玉萌，高小丽

(西北农林科技大学农学院；旱区作物逆境生物学国家重点实验室，杨凌 712100)

小粒黑豆是黄土高原地区主栽的黑色大豆品种之一，尤以陕北等地栽培较多，因具有极强的抗逆性和适应性，其在当地农业生产中占有重要地位[1]。小粒黑豆既含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸和其他矿质元素，又含有黄酮、酚类物质、花色苷等生物活性成分[2, 3]，可开发成多种食药兼用型产品[4, 5]。

在食品加工领域中，萌发处理是用来改善种子品质的一种重要方法。萌发作为一种经济有效的加工方式，能够迅速打破大豆种子的休眠状态，激活其内源酶[6, 7]和各种代谢通路[8]，提高种子中活性成分的含量，从而改善其营养保健功能。同时，萌芽处理还能有效降低大豆中脂肪酸氧化酶、植酸、植物凝集素等抗营养因子的含量, 提高其食用价值[9]。酚类是芳香烃环上连接1个或多个羟基的化合物,其有助于提高植物性食物整体的抗氧化性,是极佳的营养保健活性成分[10]。发芽可显著提高豆类的酚类物质含量，且在发芽后期出现最大值[11,12]。Aguilera等[13]研究表明，绿豆和扁豆发芽后总酚类物质增加，抗氧化活性增强。大豆中的黄酮类物质是天然的有效活性成分，其具有抗氧化、提高机体免疫功能和调节血脂血压等作用[14]。未经处理的大豆异黄酮含量极低，经萌芽处理后，异黄酮含量显著增加[15]。李振艳等[16]研究发现，发芽48 h的大豆异黄酮含量相比于未发芽的干大豆上升了92.1%。王莘等[17]发现不同豆类的活性物质含量达到最大值的萌发时间不同，大豆、绿豆和黑豆的异黄酮在萌发40、39、54 h时达最大值，皂苷则在萌发20、39、54 h时达最大值。罗旭等[18]发现4种大豆抗氧化能力与总多酚、总黄酮、异黄酮含量显著相关，曾庆真等[19]利用DPPH和ORAC法测定大豆萌发过程中芽、茎和子叶的抗氧化活性，也得出了相同的结论。由此可见，萌芽可作为提高豆类活性成分含量和改善豆类抗氧化功能的重要手段之一，研究萌发对小粒黑豆活性组分及抗氧化能力的影响对其开发利用具有指导意义。

目前关于萌发对小粒黑豆功能特性的影响研究鲜有报道，本研究探讨小粒黑豆萌芽过程中活性组分及抗氧化能力的变化规律，旨在揭示小粒黑豆萌芽期间的功能特性，为小粒黑豆芽菜生产及多元化开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以黄土高原“神木连枷条”、“定边小黑豆”和“子洲小黑豆”品种为实验材料，分别简称SM、DB和ZZ。

1.2 发芽小粒黑豆样品的制备

挑选籽粒饱满且无病害的不同品种小粒黑豆种子各300 g左右，3次重复。首先用蒸馏水冲洗表面的杂质和悬浮瘪粒，然后取适量蒸馏水浸泡3 h。浸泡结束后，再用蒸馏水冲洗除去豆子表面黏性杂质。将浸泡后的小粒黑豆表面的水分沥干后，放入发芽机中，均匀摊开铺平，并用遮光布进行遮光，发芽温度控制在23～28 ℃左右。发芽过程中，每隔2 d进行冲洗并换水。每隔1 d取样，样品冷冻干燥后，粉碎、过筛、脱脂后测定活性成分和相关指标。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 提取液的制备

参考Prior等[20]和Korus等[21]方法制备提取液，并稍作修改。称取2 g脱脂后小粒黑豆粉，在25 ℃下用25 mL 70%丙酮以150次/min的振荡频率提取3 h，4 000 r/min离心10 min，收集上清液。残留物在25 ℃下用25 mL 70%丙酮再次振荡提取3 h，4 000 r/min离心10 min，然后合并提取液，-20 ℃保存备用。

1.3.2 活性组分含量的测定

1.3.2.1 总酚含量的测定

参照Xu[22]的方法，采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法测定，以没食子酸浓度为横坐标，以A765值为纵坐标做标准曲线，样品中的总酚含量以没食子酸计。没食子酸浓度与A765值之间具有极显著的线性关系，线性关系为y=71.196x+0.025，决定系数R2=0.995 9。

1.3.2.2 总黄酮含量的测定

参照Jia等[23]的方法，用芦丁制作标准曲线。以芦丁浓度为横坐标，以A510值为纵坐标做标准曲线，样品中的总黄酮含量以芦丁计。芦丁浓度与A510值之间具有极显著的线性关系，线性关系为y=10.401x-0.065 9，决定系数R2=0.992 5。

1.3.2.3 总花色苷含量的测定

参照Jeng等[24]的方法，采用pH示差法测定，样品中的总花色苷含量以矢车菊素-3-葡萄糖苷计。

1.3.3 抗氧化能力的测定

1.3.3.1 DPPH·清除能力的测定

参照Xu[22]的方法，将方法中的无水甲醇换成无水乙醇。

1.3.3.2 O2-·清除能力的测定

参照Beauchamp等[25]方法。

1.3.3.3 ·OH清除能力的测定

参照Li等[26]的方法。

1.3.4 数据统计与分析

采用Duncan’s多重比较法进行显著性分析，Origion 2021进行绘图，SPSS 25.0软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 萌发对小粒黑豆活性组分的影响

2.1.1 总酚含量的变化

植物多酚类物质是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物，是天然的抗氧化剂。由图1可知，SM和ZZ各发芽时期的总酚含量差异显著，随着发芽时间的延长，SM、DB和ZZ总酚含量均呈持续升高的趋势。3种小粒黑豆均在芽菜生长的第5天总酚含量达到最高值，分别为9.93、12.21、15.72 mg/g，相比发芽第1天依次上升了70.62%、58.78%、151.12%，可见发芽有利于小粒黑豆中多酚的累积，其中ZZ对多酚的积累效果最为明显。有研究发现大豆总多酚含量随萌发时间延长呈持续上升趋势[27]，秦高一鑫等[28]在豌豆中也发现了同样的规律，这与本研究结果一致，可能是豆粒在萌芽过程中，受到外界环境因子的影响以及自身结构的改变，内源酶作用植物组织合成具有活性的次级代谢产物，使多酚含量显著提高。

图1 萌发过程中豆芽总酚含量

2.1.2 总黄酮含量的变化

目前，关于豆类中黄酮含量的研究较少，大多是关于异黄酮的研究[29, 30]。黄酮类化合物是小粒黑豆中的主要活性物质之一。由图2可以看出，小粒黑豆的总黄酮含量随着萌发天数的增加，基本上呈现先升高后降低的单峰变化趋势。SM和ZZ在萌发第3天时总黄酮含量最高，分别为3.58、5.63 mg/g，相比于萌发第1天分别上升了17.38%和86.42%，ZZ在萌发第3天时总黄酮含量急剧上升，为第2天的1.72倍。DB的总黄酮含量在萌发第2天和第3天差异并不显著，其在萌发第4天时达到峰值，为3.26 mg/g。本研究结果与张桂芳等[31]的研究结果一致，这可能是由于大量生物酶在萌发前期被激活，刺激了种子中活性物质的释放，但随着萌发时间的延长，在酶催化作用下形成的黄酮类化合物结构发生改变，无法与Al3+形成稳定的铝络合物，从而引起测定的总黄酮含量降低。

图2 萌发过程中豆芽总黄酮含量

2.1.3 总花色苷含量的变化

花色苷是重要的抗氧化活性物质，能够与自由基反应清除自由基从而消除氧化作用。由图3可以看出，小粒黑豆在萌发后1～5 d内，其总花色苷含量呈现明显的单峰变化趋势，花色苷含量在发芽前期增长较快，SM、DB和ZZ在萌发第1、2、3 天时的总花色苷含量均存在显著差异。SM、DB和ZZ分别在萌发第3、4、3天达到最高值，依次为19.41、15.86、24.64 mg/g，分别是萌发第1天的1.95、3.10、11.79倍，ZZ对花色苷的富集作用最为显著。

图3 萌发过程中豆芽总花色苷含量

2.2 萌发对小粒黑豆抗氧化能力的影响

2.2.1 DPPH·清除能力的变化

豆类萌发过程中，籽粒中储藏的物质发生分解，合成新的化合物，这一生理生化特征发生显著变化的活跃过程会促使多酚、黄酮、GABA等活性物质含量急剧上升，并且随着发芽时间的延长，DPPH·清除等抗氧化能力增强[32, 33]。由图4可以看出，在发芽第1天，3种小粒黑豆的DPPH·清除能力均在30%左右。随着发芽时间的延长，SM、DB和ZZ的 DPPH·清除能力呈现出不同的趋势。SM在萌发的第2天出现凹谷现象，其第2天的DPPH·清除能力为28.63%；DB呈现先升高后降低的趋势，在第3天达到最大值44.96%；ZZ则呈持续升高的变化趋势，在第5天达到峰值，为49.74%，相较萌发第1天上升了58.86%。

图4 萌发过程中豆芽清除DPPH·能力

2.2.2 O2-·清除能力的影响

由图5可以看出，不同品种小粒黑豆在萌发的1～5 d内，O2-·的清除能力基本呈现持续升高的趋势，均在芽菜生长的第5天达到最大值，SM，DB和ZZ最大清除率分别为54.54%、43.77%和44.71%，依次是萌发第1天的1.83、1.53、1.93倍，可见萌发能够有效提高小粒黑豆的O2-·清除能力。

图5 萌发过程中豆芽清除O2-·能力

2.2.3 ·OH清除能力的变化

由图6可以看出，不同品种小粒黑豆萌发过程中·OH清除能力不同，在萌发第1天，3种小粒黑豆的·OH清除能力在57%～62%之间。随着萌发天数的增加，DB和ZZ的·OH清除能力呈先升高后降低的趋势，分别在萌发的第2、4天达到峰值，峰值依次为70.50%和60.54%；SM的·OH清除能力呈“波浪形”，先增强后减弱，在第3天出现最低值54.05%，之后再增强，并在第5天达到峰值68.68%。不同品种小粒黑豆在萌发过程中·OH清除作用变化趋势不同，如SM在萌发过程中，随着萌发天数增加，·OH清除能力表现出先升高后降低，然后再升高两个极值的现象，这与魏美霞等[34]、郭鸽等[35]在绿豆和大豆上的研究结果相似，但DB和ZZ与此结果不完全一致，可能是由于品种特性和遗传因素不同，在萌发过程中产生了其他影响自由基清除作用的物质，具体原因有待进一步探索。

图6 萌发过程中豆芽清除·OH能力

2.3 萌发过程中小粒黑豆活性组分与抗氧化能力的相关性分析

对小粒黑豆总酚、总黄酮、总花色苷、DPPH·清除能力、O2-·清除能力和·OH清除能力进行相关性分析，结果见表1。ZZ的DPPH·清除能力与总酚含量呈极显著正相关关系，DB的DPPH·清除能力与总黄酮和花色苷含量均呈显著正相关关系，SM和ZZ的O2-·清除能力和总酚含量均呈显著正相关关系。相关性分析结果表明，3种小粒黑豆抗氧化能力大小与总酚、总黄酮、总花色苷中某一成分含量高低有关。不同品种之间黄酮、总酚及花色苷含量与抗氧化性能力的相关性存在一定的差异，这可能与品种特性和遗传因素有关，具体原因有待进一步探索。

表1 抗氧化能力与活性组分含量的相关性分析

3 结论

萌发能够显著提高小粒黑豆活性物质含量和抗氧化能力。参试的3种小粒黑豆在萌芽过程中，总酚含量、花色苷含量均呈不断上升趋势，O2-·清除能力的增强效果最为显著。“子州小黑豆”出现峰值时的总黄酮、总酚和花色苷含量均显著高于其他两个品种。相关性分析表明，“子洲小黑豆”的DPPH·清除能力和O2-·清除能力与总酚含量分别呈极显著正相关和显著正相关关系。相对而言，“子洲小黑豆”更具有开发功能性产品的潜力。萌发处理可作为一种提高小粒黑豆及其制品营养价值和生物利用率的有效方法，但不同品种以及萌发时间都会对产品的活性组分及抗氧化能力产生一定的影响，因此，生产上可根据产品加工对各功能成分的需求选择优质专用品种，并确定适宜的萌发时间。