安徽省临床分离致泻性大肠埃希菌主要流行基因型及同源性分析

李 春，孟昭倩，王 利，郭 辉，栗薇薇

(1. 安徽省疾病预防控制中心微生物检验室 安徽省医疗卫生重点专科病原微生物分子生物学实验室，安徽 合肥 230601； 2. 阜阳市疾病预防控制中心检验科，安徽 阜阳 236030； 3. 马鞍山市疾病预防控制中心检验科，安徽 马鞍山 243011； 4. 蚌埠市疾病预防控制中心检验科，安徽 蚌埠 233000)

致泻性大肠埃希菌(diarrheagenicEscherichiacoli，DEC)仍是当前发展中国家引起急性胃肠炎的主要病原体之一，主要通过污染的食品或饮用水进行传播。可分为6种病理类型：肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、弥散黏附性大肠埃希菌(DAEC)、肠出血大肠埃希菌(EHEC)和肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)。除DAEC无特异的毒力基因鉴定外，其余5种病理类型都可通过特异性毒力基因进行鉴定分型[1-2]。

DEC在夏秋季节常引起一些散发病例，偶尔也会发生一些聚集性病例。基因溯源在流行病学和疾病预防控制中非常重要，其中多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分型是较常用的基因溯源方法。PFGE分型选用适当的限制性内切酶在胶块中对整个细菌染色体进行酶切，360°电泳分离，最后根据分离的条带数和大小进行基因溯源[3]。MLST是对保守基因测序分型，分辨率高，数据重复性好，常用于细菌基因分型和进化研究[2, 4-6]。

本研究主要对安徽省连续2年临床分离的DEC分别用PFGE分型和MLST进行基因同源性分析，了解该地区DEC各致病型主要流行的基因型及同源性，并比对两种分型方法的优缺点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2018—2019年安徽省9个地市哨点医院采集的腹泻患者粪便标本分离的DEC。

1.1.2 主要仪器和试剂 聚合酶链反应(PCR)仪(PTC-200)购自美国MJ公司，凝胶成像仪Gel-DocXR购自美国Bio-Rad公司，CHEF-Mapper型脉冲场凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司。GoTaq®Green Master Mix (Lot:M7122) 购于Promega公司，XbaⅠ限制性内切酶购于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用微量肉汤稀释法进行药敏试验，试验方法及药物的选择参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)—2019[7]标准。挑取新鲜纯菌落3～5个，用无菌水配制成0.5麦氏单位的菌悬液，吸取 60 μL加入12 mL肉汤管中充分混匀。向96 孔药敏板中每孔加入100 μL(约 5×105CFU/mL)的肉汤菌悬液，置湿盒中36 ℃培养20 h[8]。 质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

1.2.2 MLST 随机对2018年临床分离的DEC进行基因测序分型。根据E.coli数据库提供的大肠埃希菌 MLST方案，参考数据库和文献合成引物[8]，配制50 μL PCR扩增体系：GoTaq®Green Master Mix 2 μL，10 μmol/L的上下游引物各2 μL，无RNA酶水19 μL，DNA模板 2 μL。PCR扩增条件参照文献[9]。收集PCR产物，纯化后进行测序[2]。将基因序列导入E.coliMLST数据库中获得相应的ST型，将7对管家基因序列按(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)顺序连接后，用MEGA v6.0构建微进化树[minimum-evolution (ME) tree][4,10]。

1.2.3 PFGE分型 对2019年临床分离的DEC进行PFGE分型。①首先制备1% SeaKem Gold plug：调制4.0～4.5麦氏单位的菌悬液，吸取400 μL菌悬液至EP管中，每管中加入400 μL SeaKem Gold，充分混匀后加入plug模具中，室温凝固30 min；细菌裂解，将制备好的1% SeaKem Gold plug加入CLB裂解液中54℃温育2 h；②Plug清洗：用无菌超纯水洗2次，TE缓冲液洗4次；③DNA 酶切：取出plug，切成约2.0 mm宽的小胶条，加入200 μLXbaⅠ酶切液，37℃水浴2 h；④酶切片段电泳：将酶切后的小胶条粘贴在梳齿上，倒入1% SKG，待胶块凝固后电泳[3]。Bionumerics 6.6 软件分析。

2 结果

2.1 检出菌株情况 2018—2019年，全省9个地市哨点医院共采集1 920例腹泻患者粪便，分离DEC 268株。 病理类型为：EAEC 118株(44.0%)，其中非典型EAEC(aEAEC) 80株(29.9%)，典型EAEC(tEAEC)38株(14.2%)；ETEC 98株(36.6%)，其中ETEC 92株(34.3%)，ETEC+aEAEC 6株(2.2%)；EPEC 47株(17.5%)，其中非典型EPEC(aEPEC)45株(16.8%)，典型EPEC(tEPEC)2株(0.7%)；EIEC 5株(1.9%)。病原菌来源地分布：马鞍山市78株(29.1%)，阜阳市62株(23.1%)，合肥市50株(18.7%)，蚌埠市27株(10.1%)，淮南市18株(6.7%)，亳州市16株(6.0%)，池州市7株(2.6%)，滁州市6株(2.2%)，芜湖市4株(1.5%)。

表1 四种致病型DEC对13种抗菌药物的药敏结果[株(%)]

2.3 MLST结果 随机对2018年临床分离的127株DEC 进行MLST，共获得60个ST型，其中EAEC和ETEC少数菌株存在ST48和ST394型交叉。55株EAEC分为35个 ST型，优势基因型是ST10(14.5%)；55株ETEC分为14个ST型，优势基因型是ST48(32.7%)和ST218 (16.4%)；15株EPEC分为12个ST型，优势基因型是ST28、ST517和ST2088，各占13.3%；2株EIEC分为ST6和ST99。见表2。15株EPEC微进化树分析有2组100%同源，其中1组4株(2株分离自马鞍山市，1株分离自合肥市，1株分离自芜湖市)，另1组2株菌分离自马鞍山市，见图1。55株ETEC微进化树分析有5组100%同源，其中1组5株菌分离自马鞍山市，另有2组2株菌均分离自马鞍山市，还有1组9株菌(5株分离自合肥市，3株分离自马鞍山，1株分离自阜阳市)，见图2。55株EAEC微进化树分析有4组100%同源，其中1组3株(2株分离自阜阳市，1株分离自合肥市)，1组2株分离自滁州市，其余2组2株菌均分离自不同地方，见图3。

图1 15株EPEC 微进化树图 (MEGA v6.0)

图2 55株ETEC和2株EIEC 微进化树图 (MEGA v6.0)

图3 55株EAEC 微进化树图 (MEGA v6.0)

表2 主要致病型DEC的MLST结果

2.4 PFGE分型结果 2019年临床分离的109株DEC基因同源性聚类分析结果显示，50株EAEC(tEAEC 18株，aEAEC 32株)中有2株100%同源，分离自蚌埠市，其余菌株同源性均在90%以下，见图4；21株EPEC同源性均在75%以下，见图5。30株ETEC、3株EIEC和5株ETEC+aEAEC中，同源性达97.6%、93.6%各2株，其余菌株同源性均在90%以下，见图6。

注：2019年安徽地区分离的50株EAEC 与数据库中2014年已上传的10株EAEC聚类分析； Fuyang City为阜阳市，Funan County为阜南县，Hefei City为合肥市，Bengbu City为蚌埠市，Ma’anshan City为马鞍山市，Huainan City为淮南市，Bozhou City为亳州市，Lu’an City为六安市。

注：2019年安徽地区分离的21株EPEC与数据库中2013—2014年已上传的13株EPEC聚类分析； Fuyang City为阜阳市，Funan County为阜南县，Hefei City为合肥市，Bengbu City为蚌埠市，Ma’anshan City为马鞍山市，Huainan City为淮南市，Bozhou City为亳州市。

注：2019年安徽地区分离的30株ETEC、3株EIEC、5株ETEC+aEAEC与数据库中2013年上传的4株ETEC和1株EIEC聚类分析； Fuyang City为阜阳市，Funan County为阜南县，Hefei City为合肥市，Bengbu City为蚌埠市，Ma’anshan City为马鞍山市，Huainan City为淮南市，Bozhou City为亳州市。

3 讨论

本研究资料显示，安徽地区流行的DEC存在4种优势毒株，其中以EAEC为主，占44.0%，其次是ETEC(36.6%)、EPEC(17.5%)和EIEC(1.9%)，未从患者粪便中检测出EHEC，提示本地区流行的DEC主要是EAEC、ETEC和EPEC，与张子科等[11]统计的结果基本相吻合。

2019年复旦大学附属华山医院的监测数据[15]显示，耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(CRE)检出率为20.4%，肺炎克雷伯菌中耐碳青霉烯类菌株检出率为42.9%，临床耐药菌株尤其是CRE呈增长趋势。但DEC中近年才检出CRE，本研究在2013—2018年的监测数据中均未发现耐碳青霉烯类DEC，仅2019年发现2株EAEC和1株ETEC对亚胺培南耐药，后续将对其耐药机制和传播机制进行研究。

MLST结果显示，127株DEC共检出60个ST型，呈高度多态性。其中55株EAEC分为35个 ST型，以ST10(14.5%)和ST34(5.5%)略占优势，与Okeke等[16]报道Nigeria临床分离的126株EAEC多达96种ST型的多态性分布相近。微进化树分析显示，有少数菌株呈100%同源，但空间分布广泛，提示无聚集性感染。 50株EAEC的PFGE同源性聚类分析仅有2株出现100%同源性，分离自蚌埠市，其余菌株的同源性均小于90%。同样提示EAEC高度多态性分布，无聚集性感染。Li等[5]报道深圳地区分离的ETEC基因型较分散，ST218为相对优势基因型，本研究中55株ETEC分为14个ST型，优势基因型是ST48(32.7%)、ST218 (16.4%)和ST1491(12.7%)，说明本地区临床分离的ETEC基因型较集中，ST48为主要优势基因型，提示不同地区ETEC基因型存在差异性。55株ETEC微进化树分析发现有多达5组100%同源，其中有多株菌分离自马鞍市，提示存在地区聚集性感染的可能性，但流行病学调查未发现暴发或聚集性病例。研究发现同源性感染存在时间差异，因此未出现聚集性病例，可能与菌株的克隆传播有关。30株ETEC PFGE同源性聚类分析发现，同源性达97.6%、93.6%各2株，其余菌株同源性在90%以下。15株EPEC分为12个ST型，呈多态性分布，其中以ST28(13.3%)、ST517(13.3%)和ST2088(13.3%)略占优势。15株EPEC微进化树分析显示，少数菌株呈100%同源性，空间分布广泛，提示无聚集性病例出现。21株EPEC PFGE同源性聚类分析显示同源性均在75%以下。

PFGE和MLST同为两种分子分型方法，两者各有优缺点，可以互为补充用于致病菌的分型和基因溯源分析。从本研究分型结果看，两者作用相同，均可用于分析致病菌的同源性，并且两种分型方法获得的结果也近似。但MLST是通过基因测序，其准确度要高于PFGE法，在本研究中MLST法对ETEC同源性的判断要比PFGE法更精准。但PFGE法的优势是普及程度高，可用于大范围多样本的分析判断。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。