柠檬明串珠菌BD1707的胞外多糖合成酶特性

刘景玉

（光明乳业股份有限公司乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术中心，上海 200436）

柠檬明串珠菌（Leuconostoccitreum）是从谷物和蔬菜（如酸面团、酸菜和泡菜）发酵中分离出来的革兰氏阳性乳酸菌[1]。柠檬明串珠菌作为食品用发酵剂的使用日益普遍。基于培养和宏基因组的泡菜微生物区系分析表明，柠檬明串珠菌是泡菜发酵早期和中期的优势微生物，因此可用作发酵剂[2-3]。2008年，Kim等[4]报道柠檬明串珠菌的全基因组序列，该菌是从低温发酵的韩国泡菜中分离出的名为柠檬明串珠菌KM20的菌株，它可以抑制病原微生物的生长，如蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞菌和血清型鼠伤寒沙门氏菌。目前NCBI共收录33 个柠檬明串珠菌的全基因组数据，平均G+C含量约为40%，平均基因组大小约为1.9 Mb，并且多个菌株中包含有至少1 个质粒[5]。

细菌胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）是由细菌合成的结构多样的生物聚合物，具有物理化学和功能特性，使它们成为微生物合成的重要产物，具有广泛和多功能的生物技术潜力[6]。柠檬明串珠菌产生的EPS有右旋糖酐、交替葡聚糖、果聚糖、菊粉等，它们的结构如图1所示[7]。右旋糖酐是由D-葡萄糖以α-1,6糖苷键连接的主线性链葡聚糖[8]，由右旋糖酐蔗糖酶（dextransucrase，DS）催化产生。DS属于细胞外酶、细胞结合酶或二者兼有，取决于不同的菌株来源[9]。DS是大型酶，分子质量为64～184 kDa[10-12]，催化的反应是以蔗糖为底物产生葡聚糖和果糖单糖。交替葡聚糖是一种支链葡聚糖，具有独特的交替α-1,3和α-1,6-D-糖苷键主链结构，由交替蔗糖酶催化蔗糖底物反应产生[13]。果聚糖是直链主链中含有β-2,6糖苷键的多糖，偶尔具有β-2,1糖苷键分支点，而菊粉则相反（主链中含β-2,1糖苷键，分支点为β-2,6糖苷键）[14-15]。果聚糖蔗糖酶（levansucrase，LS）负责将蔗糖底物转化为果聚糖和葡萄糖，已报道的LS分子质量通常较小，为45～64 kDa[16]。葡聚糖和果聚糖都具有广泛的特性，主要取决于它们的连接模式，尽管在某些方面有所不同，但为它们在许多领域，特别是在食品工业和生物医学中的通用应用提供了合适的先决条件[17-18]。

图1 4 种同型多糖的化学结构式Fig. 1 Schematic chemical formulae of four extracellular homopolysaccharides

目前已有多个国内外课题组报道了柠檬明串珠菌所产生的EPS结构。Bounaix等[8]从多株柠檬明串珠菌的产物中鉴定出产生的葡聚糖。Abid等[19]从柠檬明串珠菌BMS中分离出在第3位分支的α-1,6-葡聚糖和β-2,6-果聚糖。Han Jin等[20-21]报道，柠檬明串珠菌BD1707在番茄汁中可以将蔗糖底物转化为果聚糖。表1总结了目前已报道的部分柠檬明串珠菌菌株与它们对应的EPS产物类型。现有的大部分报道都鉴定出EPS结构，但是对应催化这些EPS产生的酶却研究较少。本研究旨在探索柠檬明串珠菌BD1707菌株中可能催化果聚糖产生的相关酶，建立酶与产物的对应关系。

表1 部分柠檬明串珠菌产生的EPS及其相关合成酶Table 1 EPS and related synthases produced by some strains of L. citreum

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬明串珠菌BD1707，本实验室分离自藏灵菇，现已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC6431）。

MRS培养基（固体培养基另加1.5%～2.0%琼脂）、葡萄糖、蔗糖（均为分析纯） 德国Merck公司；硫酸铵、醋酸钠、氯化钙（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝超快染色液 上海碧云天生物技术有限公司；surePAGETM非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）预制胶（4%～20%） 南京金斯瑞生物科技有限公司；20×MOPS、5×Native Loading、20×磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline ，PBS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白标准Marker 1610374 美国Biorad公司。

1.2 仪器与设备

TE612-L电子天平、BSA124S-CW电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司；GNP-9270隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；ZWY-2102C恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；Milli-Q超纯水仪 默克化工技术（上海）有限公司；Avanti J-30I落地式离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；TOMY-SX-70全自动高压灭菌锅 日本Tomy公司；17R高速离心机、Orion 3 STAR pH计 美国Thermo Scientific公司；SW-CJIBU超净工作台 苏州苏净集团；FreeZone 12真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；RH-KT/C磁力搅拌器 德国IKA公司；Mini-PROTEIN 3 system电泳仪 美国Bio-Rad公司；850离子色谱仪（配备919自动进样器） 瑞士万通公司。

1.3 方法

1.3.1 番茄汁培养基的制备

将新鲜番茄榨汁，离心（9 000 r/min、4 ℃、20 min）后用纱布过滤；滤液加热到微沸，冷却后离心（9 000 r/min、4 ℃、20 min），将上清液用5 mol/L NaOH调至pH 6.8，用作种子发酵液；实验组加2 g/100 mL蔗糖，调至pH 6.8，对照组加2 g/100 mL葡萄糖，调至pH 6.8，分装后118 ℃灭菌15 min。番茄榨汁得率约为0.9 L/kg。用接种环挑取单菌落接种到100 mL种子培养基中，28 ℃摇床180 r/min过夜培养18 h，分别按5%接种量加入到实验组和对照组中，28 ℃摇床180 r/min培养24、72 h[20]。

1.3.2 蛋白沉淀和处理

收集1.3.1节培养后的发酵液和菌体，离心（9 000 r/min、4 ℃、20 min）；菌体用pH 7.5的PBS悬浮后用超声波细胞破碎仪破碎，超声功率300 W，单次破碎时长5 s，间歇时长5 s，工作总时长30 min，处理完毕后，离心（12 000 r/min、4 ℃、20 min），取上清得到酶液。向发酵液和菌体破碎液上清中分别缓慢加入研磨的硫酸铵粉末，边加边搅拌，待硫酸铵全部溶解后再继续搅拌30 min，使溶液中硫酸铵的饱和度分别达到20%、40%、60%、80%、100%；4 ℃过夜，离心（18 000 r/min、4 ℃、20 min），沉淀用适量纯水复溶；复溶的蛋白用15 kDa透析袋在0.1 g/100 mL CaCl2溶液中透析24 h，透析袋中的液体冻干保存。

1.3.3 原位反应

称量5 mg冻干样品，溶于0.5 mL PBS中，离心（12 000 r/min、4 ℃、10 min）取上清，得蛋白样品。将Native Loading与蛋白样品混合后，用4%～20%的Native-PAGE预制胶在110 V电压下电泳80 min。得到的蛋白胶一半用考马斯亮蓝染色，另一半用pH 5.5、20 mmol/L NaAc溶液洗脱至少2 次后，置于含5 g/100 mL蔗糖的pH 5.5、20 mmo/L NaAc溶液中（加入0.03 g/100 mL的NaN3溶液防止染菌），30 ℃恒温放置48 h后在暗室观察原位反应产物。

1.3.4 胶内产物及单糖组成分析

取少量胶内提取的产物a、b、c和蔗糖、葡萄糖标品点样于薄层层析（thin-layer chromatograhpy，TLC）硅胶板，然后置于展开剂（乙腈∶乙酸乙酯∶异丙醇∶蒸馏水=5.0∶1.0∶2.5∶1.0，V/V）中展层，约25 min后取出，雾喷显色剂后于120 ℃烘箱中烘5 min，糖斑点显色较明显后进行扫描拍照。

单糖组成分析：向产物a、b、c中分别加入1 mol/L盐酸溶液，100 ℃水解2 h，水解液中加入CaCO3中和至不冒泡；样品离心（12 000 r/min、4 ℃、10 min）后，对水解单糖进行测定。离子色谱条件：安培脉冲检测器；色谱柱：Carb1柱（4×250 mm）；流动相：15 mmol/L NaOH；等梯度洗脱，流速1 mL/min；色谱柱温度30 ℃；进样量20 μL；柱温30 ℃；进样盘温度4 ℃。

1.4 数据处理

采用Chemdraw 17.0软件和Excel 2013软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 硫酸铵分级沉淀分析

对柠檬明串珠菌BD1707发酵24 h的发酵液和菌体破碎液上清进行饱和硫酸铵分级沉淀，离心后的沉淀溶解后进行Native-PAGE原位活性初步测试。由表2可知，60%饱和度条件下，硫酸铵沉淀的蛋白样品活性测试得到的对应产物条带最亮，40%饱和度条件下，硫酸铵沉淀的蛋白样品活性测试表明能得到少量产物，而饱和度高于60%和低于20%时，硫酸铵沉淀的蛋白样品活性测试几乎看不到产物条带。表明硫酸铵饱和度达到60%时，需要的活性蛋白能被完全沉淀出来。因此选用饱和度60%硫酸铵作为活性蛋白的最终提取条件。在细胞裂解液中未看到明显的产物产生，表明细胞内没有活性蛋白，目标蛋白在细胞外。

表2 饱和硫酸铵分级沉淀蛋白的初步原位活性测试结果Table 2 Results of in situ activity tests of proteins precipitated with ammonium sulfate

2.2 Native-PAGE蛋白电泳分析

对柠檬明串珠菌BD1707大量发酵24 h和72 h后，将发酵液硫酸铵饱和度为60%时沉淀收集的蛋白样品用含4%～20%聚丙酰胺的Native-PAGE胶进行电泳检测。蛋白胶经考马斯亮蓝染色，由图2A可知，经过上述步骤后得到的蛋白混合物中，实验组比对照组在约150 kDa处多出一条明显的条带，并且实验组24 h与72 h样品均出现该条带，而对照组则没有出现该条带。表明蔗糖能在番茄汁中诱导柠檬明串珠菌BD1707产生150 kDa大小的蛋白并分泌到胞外。在接近100 kDa的位置，实验组和对照组均有明显的蛋白条带，该条带较宽，可能含有多种蛋白，不能直接从染色胶图中看出差异。150 kDa处的蛋白是否具有聚合活性还需要进一步实验验证，已有报道中鲜有发现该分子质量的果聚糖聚合酶，葡聚糖蔗糖酶和菊粉蔗糖酶已有与该分子质量接近甚至分子质量更大的蛋白被报道[11,22]。由于之前的报道中柠檬明串珠菌BD1707产生的胞外多糖是果聚糖[20]，因此推测该蛋白可能是一个新型果聚糖蔗糖酶。

图2 Native-PAGE分析结果Fig. 2 Results of native-PAGE analysis

2.3 原位活性测试分析

由图2B、C可知，在暗室观察原位活性测试48 h的蛋白胶，发现实验组出现3 条明显的半透明条带，而对照组则没有出现，这些新出现的条带为被固定在Native-PAGE胶上的酶催化蔗糖底物产生的多糖。其中a条带对应的酶分子质量约为150 kDa，推测可能对应图2A中的考马斯亮蓝染色条带，而b、c条带对应的酶分子质量约为90、80 kDa，未能在图2A对应的位置看到明显的考马斯亮蓝染色条带，可能是由于背景杂蛋白掩盖，或者是该蛋白含量未达到蛋白胶检测限。上述3 个大小的蛋白从培养24 h样品中开始出现，到培养72 h依然存在，且产物条带亮度相似，表明在酸性条件下它们的稳定性较高，发酵后期的pH值接近4.0[20]。

以上结果表明，通过60%饱和硫酸铵沉淀的发酵液中的蛋白具有聚合活性，这3 个不同大小的酶均能利用蔗糖作为底物产生多糖。由于之前的报道中柠檬明串珠菌BD1707产生的EPS是果聚糖[20]，因此推测3 个蛋白合成的都是果聚糖。

2.4 多糖产物的单糖组成分析

由图3可知，通过TLC检测可以发现，Native-PAGE蛋白胶上条带a、b、c对应的多糖产物a、b、c均不能在TLC板中展开，而标品葡萄糖和蔗糖均能展开，表明a、b、c均为分子质量较大的多糖产物且不含寡糖和单糖等小分子，从TLC检测结果无法看出多糖产物a、b、c的结构区别。

图3 产物TLC分析Fig. 3 TLC analysis of products

为了增加检测的准确性，将多糖产物a、b、c一起水解，用分析柱检测其单糖组成。由图4可知，与果糖标品对比，3 种多糖酸解后的单糖为果糖，表明它们均为果聚糖，与Han Jin等[20]的报道和之前的推测一致。由于提取的多糖产物a、b、c含量较少，无法判断它们的聚合度和结构差异。

图4 原位活性产物的单糖组成分析Fig. 4 Analysis of monosaccharide composition of in situ active product

3 结 论

柠檬明串珠菌BD1707在含蔗糖的番茄汁中能产生果聚糖，但是与之相关的合成酶鲜有研究。本研究通过饱和硫酸铵分级沉淀实验发现，硫酸铵饱和度为60%时能将柠檬明串珠菌BD1707番茄汁发酵液中的活性蛋白完全沉淀下来，并且合成多糖的活性蛋白存在于细胞外。Native-PAGE后考马斯亮蓝染色发现，实验组多出一条明显的分子质量150 kDa的蛋白条带。Native-PAGE胶原位活性测试实验发现，沉淀出的蛋白能产生3 个聚合条带，分子质量最大约为150 kDa，另外2 个分子质量接近90、80 kDa，表明柠檬明串珠菌BD1707的番茄汁发酵液中含有3 种分子质量不同的果聚糖蔗糖酶。TLC和单糖组成分析进一步确定了不同分子质量的蛋白合成产物a、b、c都是果聚糖，目前还不能确定这3 个产物在聚合度和结构上是否有差异，3 个蛋白的分子质量比目前已报道的果聚糖蔗糖酶分子质量要大，可能是果聚糖蔗糖酶家族的新成员。本研究初步确立了柠檬明串珠菌BD1707产生的果聚糖与其合成酶的对应关系，为后续果聚糖蔗糖酶的酶活研究提供了参考。